【摘要】：背景肝細胞癌(肝癌)在全球惡性腫瘤中發(fā)病率居第五位,死亡率居第三位。由于早期無特異表現、治療后易復發(fā),肝癌病人整體預后較差,是威脅人類健康的重大醫(yī)療問題。因此,尋找用于精準早期診斷的的生物標志物和有效的治療靶點是肝癌研究的重點。近年來發(fā)現miR-217已被證實在胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤中異常表達,但是在肝癌中miR-217的作用機制仍不明確。異黏蛋白(MTDH)是一種含582個氨基酸的單跨膜蛋白,其在多種腫瘤中均有異常高表達,且其表達水平與腫瘤的進展正相關。MTDH基因的表達還與癌癥進展的階段、分期、以及預后相關。MTDH基因通過調控癌癥過程中的多個信號通路參與癌癥進程,因此MTDH是一個潛在的治療靶點。目前對于MTDH在肝癌中的表達調控機制研究還比較少。miRNA能通過間接或者直接調控MTDH的的表達,在結直腸癌中是miRNA間接調控MTDH,在乳腺癌、人頭頸部鱗狀細胞癌中都是miRNA直接調控MTDH的實例,然而對于miR-217與MTDH的關系尚不明確。我們通過對患者肝癌組織和HepG2細胞的研究,探索miRNA-217介導MTDH在肝癌發(fā)生發(fā)展中的相關研究及作用機制。目的1.檢測miR-217和MTDH在肝癌和癌旁組織中的差異性表達,探討其相關性;2.驗證miR-217與MTDH基因的靶向作用關系;3.檢測miR-217對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響。方法1.自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院病理科收集20例肝癌和癌旁組織,分別采用實時熒光定量PCR及Western Blot檢測其中miR-217、MTDH mRNA和蛋白水平的表達;2.通過TargetScan預測miR-217與MTDH的結合位點,分別構建MTDH基因3'-UTR區(qū)的野生型和突變型熒光素酶報告質粒,與miR-217 mimics共轉染HepG2細胞,檢測其熒光表達變化。在HepG2細胞中過表達miR-217,通過實時熒光定量PCR、Western Blot及免疫熒光分別檢測細胞中MTDH的mRNA和蛋白的表達變化,驗證miR-217對MTDH的靶向作用;3.在HepG2細胞中過表達miR-217,通過MTT、流式細胞術、Transwell實驗檢測miR-217對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學特性的影響。結果1.在20例肝癌和癌旁組織中,miR-217在肝癌中的表達量較癌旁組織明顯降低(40%),而MTDH mRNA在肝癌中較癌旁組織表達高近一倍,MTDH蛋白水平的表達mRNA水平一致。2.通過轉染miR-217 mimics,成功在HepG2細胞中過表達miR-217,miR-217顯著抑制野生型MTDH 3'-UTR載體的熒光強度,對突變型MTDH 3'-UTR載體無明顯作用。過表達miR-217明顯抑制HepG2細胞中MTDH mRNA和蛋白的表達,證明了 miR-217直接靶向于MTDH基因的3'-UTR區(qū),從而抑制MTDH基因的表達。3.在HepG2細胞中過表達miR-217,通過CCK-8實驗和流式細胞周期檢測發(fā)現:較之空白及陰性對照組,過表達miR-217能顯著抑制HepG2細胞的增殖,并增加處于G1期、減少S期的HepG2細胞;同時,過表達miR-217,促進HepG2細胞的凋亡;Transwell實驗結果表明,過表達miR-217后,轉移到下室中的細胞明顯減少,證明miR-217顯著抑制HepG2細胞的遷移和侵襲。結論1.在肝癌組織中miR-217表達下調,MTDH表達上調。2.miR-217靶向作用于MTDH,抑制其表達。3.miR-217能夠顯著抑制HepG2細胞的增殖、侵襲和遷移并促進HepG2細胞的凋亡。
[Abstract]:BACKGROUND Hepatocellular carcinoma (HCC) ranks fifth in the incidence of malignant tumors worldwide, and its mortality ranks third. Because of its early non-specific manifestations, easy recurrence after treatment and poor overall prognosis of HCC patients, it is a major medical problem threatening human health. In recent years, it has been found that the expression of microRNAs-217 is abnormal in gastric cancer, prostate cancer and other malignant tumors. However, the mechanism of action of microRNAs-217 is still unclear in hepatocellular carcinoma. The expression of MTDH gene is also associated with the stage, stage and prognosis of cancer. MTDH gene is involved in the cancer process by regulating multiple signaling pathways in the cancer process, so MTDH is a potential therapeutic target. Or directly regulate the expression of MTDH, in colorectal cancer is the indirect regulation of MTDH by microRNAs, in breast cancer, human head and neck squamous cell carcinoma are all examples of direct regulation of MTDH by microRNAs. However, the relationship between microRNAs-217 and MTDH is still unclear. Objective 1. To investigate the differential expression of microRNAs-217 and MTDH in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues, 2. To verify the targeting effect of microRNAs-217 on MTDH gene, 3. To investigate the effects of microRNAs-217 on the proliferation, apoptosis, migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Twenty cases of hepatocellular carcinoma and adjacent tissues were collected from the Department of Pathology, Southern Hospital of University, and real-time fluorescence quantitative PCR and Western Blot were used to detect the expression of microRNAs-217, MTDH mRNA and protein levels. 2. Wild-type and mutant luciferase reporter plasmids in the 3'-UTR region of MTDH gene were constructed by predicting the binding sites of microRNAs-217 and MTDH by TargetScan. Mi-217 mimics were co-transfected into HepG2 cells to detect their fluorescent expression. Mi-217 was overexpressed in HepG2 cells. The expression of MTDH mRNA and protein was detected by real-time fluorescence quantitative PCR, Western Blot and immunofluorescence, respectively, to verify the targeting effect of Mi-217 on MTDH. 3. Mi-217 was overexpressed in HepG2 cells, and was detected by MTT, flow cytometry. Results 1. In 20 cases of hepatocellular carcinoma and adjacent tissues, the expression of microRNAs-217 in hepatocellular carcinoma was significantly lower than that in adjacent tissues (40%), while the expression of MTDH mRNA in hepatocellular carcinoma was nearly twice as high as that in adjacent tissues, and the expression of MTDH protein was almost twice as high as that in adjacent tissues. RNA level was consistent. 2. Mi-217 was successfully overexpressed in HepG2 cells by transfecting Mi-217 mimics. Mi-217 significantly inhibited the fluorescence intensity of wild-type MTDH-3'-UTR vectors and had no significant effect on mutant MTDH-3'-UTR vectors. Overexpression of Mi-217 significantly inhibited the expression of MTDH mRNA and protein in HepG2 cells, which proved that Mi-217 directly targeted to MTDH. Overexpression of Mi-217 in HepG2 cells was detected by CCK-8 assay and flow cytometry. Compared with blank and negative control group, overexpression of Mi-217 significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells, increased the G1 phase and decreased the S phase of HepG2 cells. At the same time, overexpression of Mi-217 promoted the proliferation of HepG2 cells. Transwell assay showed that the number of cells transferred to the lower chamber after overexpression of microRNAs-217 was significantly reduced, indicating that microRNAs-217 significantly inhibited the migration and invasion of He pG2 cells. Conclusion 1. In hepatocellular carcinoma tissues, the expression of microRNAs-217 was down-regulated and the expression of MTDH was up-regulated. 2. MicroRNAs-217 targeted at MTDH and inhibited its expression. 3. MicroRNAs-217 significantly inhibited the migration and invasion of He pG2 cells. PG2 cell proliferation, invasion and migration, and promote the apoptosis of HepG2 cells.
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：2225119