【摘要】：目的:本研究探討Wnt通路抑制基因表觀遺傳學(xué)變化,組蛋白修飾與急性白血病相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系,Genistein對Wnt通路抑制基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的影響、組蛋白修飾的影響和可能的機(jī)制;為白血病的表觀治療提供新的思路。方法:1.以qRT PCR法檢測急性白血病患者和正常人Wnt通路拮抗基因(Wnt5a,HDPR1,DKK1,DKK3)mRNA表達(dá)水平,焦磷酸鹽測序(Pyrophosphate sequencing)、甲基化特異性PCR(MSP)檢測Wnt5a基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),以Western Blot方法檢測急性髓細(xì)胞白血病、正常人Wnt5a蛋白和組蛋白H4K20me1總表達(dá)水平,分析Wnt5a蛋白表達(dá)與組蛋白H4K20me1之間的相關(guān)性;2.以Genistein作用于Wnt通路拮抗基因(Wnt5a、HDPR1、DKK1、DKK3)高甲基化失活的Jurkat、U937細(xì)胞,觀察細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期變化,檢測Wnt通路拮抗基因、H4K20me1甲基轉(zhuǎn)移酶(set8)及Wnt通路下游靶基因AXIN2、c-myc等基因表達(dá)變化,通過BSP技術(shù)、焦磷酸鹽測序檢測對照組和加藥組之間Wnt5a啟動子區(qū)甲基化變化,以染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP-qPCR)技術(shù),檢測對照組和加藥組Wnt5a基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)H4K20me、H3K9ac富集程度變化,分析Genistein如何通過組蛋白修飾對Wnt信號傳導(dǎo)通路下游靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,探索Wnt5a恢復(fù)表達(dá)與組蛋白H4K20me1的關(guān)系,及Genistein引起凋亡、細(xì)胞周期變化的可能機(jī)制。3.設(shè)計(jì)合成攜帶過表達(dá)Wnt5a基因載體的慢病毒,對低表達(dá)Wnt5a的Jurkat細(xì)胞和Kasumi細(xì)胞進(jìn)行感染,檢測過表達(dá)Wnt5a對增殖、細(xì)胞周期以及凋亡水平等細(xì)胞生物學(xué)活性的影響,并以Western Blot法檢測Wnt通路關(guān)鍵效應(yīng)蛋白β-catenin、下游靶基因c-myc、組蛋白H4K20me1、細(xì)胞周期(G2/M期)相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改變,探討Wnt5a基因在白血病細(xì)胞中的對抗增殖、誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期的機(jī)制。結(jié)果:1.Wnt通路拮抗基因(Wnt5a,HDPR1,DKK1,DKK3)在急性髓系白血病中呈廣泛低表達(dá),但在淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)呈現(xiàn)差異,其中Wnt5a在急性T淋巴細(xì)胞白血病中亦低表達(dá),DKK3在髓系、淋系急性白血病中普遍降低,而HDPR1在急淋患者中表達(dá)與正常人無顯著性差異,DKK1在急淋患者中表達(dá)顯著高于正常人。2.急性髓系白血病患者中普遍存在Wnt5a基因甲基化,導(dǎo)致其表達(dá)量下降。3.急性髓系白血病患者中H4K20me1總蛋白量較正常人升高,且Wnt5a表達(dá)量與H4K20me1表達(dá)量呈正相關(guān),與H4K20me1富集于Wnt5a啟動子區(qū)、編碼區(qū)有關(guān)。而在正常人中,Wnt5a表達(dá)量與H4K20me1表達(dá)量無相關(guān)性。4.以Genistein干預(yù)Wnt拮抗基因甲基化失活的Jurkat、U937細(xì)胞系,在體外能夠抑制Jurkat、U937細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程,并誘導(dǎo)凋亡,其作用機(jī)制與激活H4K20me1甲基轉(zhuǎn)移酶(set8),提高H4K20me1在Wnt5a等啟動子區(qū)富集,從而激活Wnt通路抑制基因,抑制Wnt/β-catenin信號途徑有關(guān);與Wnt5a啟動子甲基化狀態(tài)無關(guān)�？紤]組蛋白修飾狀態(tài)改變對Wnt通路抑制基因的激活起關(guān)鍵作用。改變組蛋白的修飾狀態(tài),可以不通過逆轉(zhuǎn)甲基化狀態(tài)達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。5.在低表達(dá)Wnt5a的細(xì)胞系Jurkat、Kasumi中,過表達(dá)Wnt5a基因,可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、阻滯細(xì)胞周期于G2/M期,與Genistein誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和周期阻滯的改變相似,考慮Genistein抗腫瘤作用主要通過提高Wnt5a表達(dá)實(shí)現(xiàn);Wnt5a過表達(dá)對組蛋白H4K20me1表達(dá)無影響;因Wnt5a在白血病細(xì)胞中可以發(fā)揮明顯的抗腫瘤作用,可能成為基因治療的重要靶點(diǎn)。結(jié)論:急性白血病患者中普遍存在Wnt通路拮抗基因的甲基化,其中在AML患者中尤為顯著,ALL則因不同患者和類型有一定差異;患者Wnt5a基因表達(dá)與基因啟動子區(qū)、編碼區(qū)H4K20me1富集倍數(shù)呈正相關(guān),H4K20me1通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄延伸提高Wnt5a的表達(dá)水平;Genistein干預(yù)白血病細(xì)胞促進(jìn)抑癌基因Wnt5a表達(dá)的重要機(jī)制是在Wnt5a啟動子區(qū)、編碼區(qū)富集H4K20me1,與啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)無關(guān);Wnt5a基因在細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡、抗增殖的作用方面具有與Genistein相似的作用機(jī)制,均可以阻止CDK1激酶活性和誘導(dǎo)P21上調(diào),激活非經(jīng)典Wnt通路,導(dǎo)致β-catenin下調(diào),Wnt經(jīng)典通路下游基因轉(zhuǎn)錄受抑。
[Abstract]:Objective: To explore the epigenetic changes of Wnt pathway inhibitor gene, the relationship between histone modification and the expression of genes related to acute leukemia, the effect of Genistein on the transcriptional regulation of Wnt pathway inhibitor gene, the effect of histone modification and its possible mechanism, and to provide a new idea for the epigenetic treatment of leukemia. Methods: 1. Quantitative RT PCR was used to detect the expression of genes related to Wnt pathway inhibitor. Expression of Wnt pathway antagonist gene (Wnt5a, HDPR1, DKK1, DKK3) mRNA in patients with acute leukemia and normal controls, Pyrophosphate sequencing, methylation-specific PCR (MSP) were used to detect methylation status of Wnt5a promoter region, and Western Blot was used to detect acute myeloid leukemia, Wnt5a protein and histone H4K20 in normal controls. To analyze the correlation between the expression of Wnt5a protein and histone H4K20me1; 2. Genistein was used to treat hypermethylation-inactivated Jurkat and U937 cells with Wnt pathway antagonist genes (Wnt5a, HDPR1, DKKK1, DKK3), to observe cell proliferation, apoptosis and cell cycle changes, to detect Wnt pathway antagonist gene, H4K20me1 methyltransferase (set8) and Wnt pathway antagonist gene. The methylation of Wnt5a promoter region was detected by BSP and pyrophosphate sequencing. The enrichment of H4K20me and H3K9ac in the promoter region and coding region of Wnt5a gene in the control group and the drug group was detected by chromatin immunoprecipitation (CHIP-qPCR). To analyze how Genistein regulates the expression of target genes downstream of Wnt signal transduction pathway by histone modification, to explore the relationship between the recovery of Wnt5a expression and histone H4K20me1, and the possible mechanism of Genistein-induced apoptosis and cell cycle changes. Cells and Kasumi cells were infected to detect the effects of Wnt5a overexpression on cell proliferation, cell cycle and apoptosis. The expression of key effector protein beta-catenin, downstream target gene c-myc, histone H4K20me1, cell cycle (G2/M phase) related protein and apoptosis related protein were detected by Western Blot assay. To investigate the mechanism of Wnt5a gene in leukemia cells by antagonizing proliferation, inducing apoptosis and blocking cell cycle. Results: 1. Wnt5a (Wnt5a, HDPR1, DKK1, DKKK3) was widely low expressed in acute myeloid leukemia, but the expression of Wnt5a was different in lymphocytic leukemia, especially in acute T lymphocytic leukemia. The expression of DKK1 in AML patients was significantly higher than that in normal controls. 2. The methylation of Wnt5a gene was common in AML patients, resulting in a decrease in the expression of H4K20me1. The expression of Wnt5a was positively correlated with the expression of H4K20me1, and was related to the coding region of H4K20me1, which was enriched in the promoter region of Wnt5a. However, there was no correlation between the expression of Wnt5a and the expression of H4K20me1 in normal people. Kat, U937 cells proliferate, block cell cycle progression, and induce apoptosis. Its mechanism is related to activating H4K20me1 methyltransferase (set8), increasing H4K20me1 enrichment in promoter regions such as Wnt5a, thus activating Wnt pathway inhibitor genes, inhibiting Wnt / beta-catenin signaling pathway, and not related to Wnt5a promoter methylation status. Changes in histone modification can regulate gene expression without reversing methylation. 5. Overexpression of Wnt5a gene in Jurkat, Kasumi cells with low expression of Wnt5a can inhibit cell proliferation, promote apoptosis and block cell cycle at G2/M phase, and Geni phase. Stein induced apoptosis and cell cycle arrest similar changes, considering the anti-tumor effect of Genistein is mainly achieved by increasing the expression of Wnt5a; Wnt5a overexpression has no effect on histone H4K20me1 expression; because Wnt5a can play an obvious anti-tumor role in leukemia cells, may become an important target of gene therapy. Wnt pathway antagonist gene methylation is common in patients with hematological diseases, especially in AML patients, and ALL has certain differences due to different patients and types; Wnt 5A gene expression is positively correlated with gene promoter region, coding region H4K20me1 enrichment multiple, H4K20me1 promotes Wnt 5A expression by promoting transcriptional initiation and transcriptional extension Genistein interferes with the expression of tumor suppressor gene Wnt5a in leukemia cells by enriching H4K20me1 in the promoter region of Wnt5a, which is not related to the methylation status of promoter region; Wnt5a gene has a similar mechanism with Genistein in cell cycle arrest, apoptosis induction and anti-proliferation, and can prevent CDK1 kinase. P21 activity and induction up-regulate, activate non-classical Wnt pathway, lead to down-regulation of beta-catenin, Wnt classical pathway downstream gene transcription is inhibited.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71

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本文編號：2212567