【摘要】：背景據(jù)美國癌癥統(tǒng)計調(diào)查顯示,2016年癌癥新發(fā)病例數(shù)為1,685,210人,相當(dāng)于每天約4,600人被確診為惡性腫瘤。在眾多類型的惡性腫瘤中,胰腺癌的死亡率是最高的,其總生存率為8%,而5年生存率只為2%,這主要是由于大多數(shù)胰腺癌患者在確診時往往已經(jīng)有遠處轉(zhuǎn)移。目前治療胰腺癌仍認為手術(shù)是最有效的手段,但即使經(jīng)過積極的治療后,其5年生存率也只有25%~35%。近年來發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenases,ALDHs)在胰腺癌中高表達,并且還和胰腺癌干細胞的特性緊密相關(guān)。另外,它不僅能夠作為鑒定和分離胰腺癌干細胞(cancer stem cells,CSCs)的表面標志物,還與胰腺癌治療過程中產(chǎn)生的耐藥、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及患者的預(yù)后等均有一定關(guān)系。二甲雙胍是目前世界上使用最廣泛的抗糖尿病的口服藥物之一。它能夠通過抑制肝臟糖異生,同時增加外周組織中胰島素的敏感性來降低血糖和胰島素濃度。一項回顧性研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可以降低糖尿病患者的腫瘤患病率和死亡率。另外,還有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅可以通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target Of Rapamycin,mTOR)通路抑制胰腺癌細胞的增殖,還能夠抑制胰腺癌動物模型中ALDH1的表達,但其作用機制尚不清楚。在本實驗中,我們通過使用mTOR抑制劑--雷帕霉素進而阻斷mTOR信號通路的激活,觀察二甲雙胍以及雷帕霉素對胰腺癌細胞和胰腺癌干細胞中ALDH1的表達水平的影響,并初步探究胰腺癌中ALDH1的表達與mTOR的關(guān)系。目的觀察二甲雙胍對胰腺癌PANC-1細胞以及胰腺癌干細胞中ALDH1表達的影響,探討其相關(guān)的作用機制。方法采用CCK-8法和Western Blot方法分別檢測不同濃度二甲雙胍對胰腺癌PANC-1細胞的增殖及對ALDH1和p-mTOR蛋白表達的影響。使用mTOR抑制劑雷帕霉素,通過Western Blot方法,免疫熒光法(Immunofluorescence)以及熒光實時定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)來檢測二甲雙胍組,雷帕霉素組以及聯(lián)合用藥組中PANC-1細胞ALDH1、4EBP1、p-mTOR蛋白及m RNA的表達。采用超低黏附培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)胰腺癌細胞,觀察不同藥物干預(yù)對胰腺癌細胞成球能力的影響,進一步采用Western Blot方法檢測胰腺癌干細胞ALDH1的表達情況;通過建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型來比較PANC-1細胞和胰腺癌成球細胞之間成瘤能力的不同。結(jié)果1.CCK-8結(jié)果:使用濃度分別為1、2、5、10、15和20 mmol/L的二甲雙胍干預(yù)胰腺癌PANC-1細胞,24 h后的細胞增殖抑制率分別為:(5.23±2.03)%、(10.23±4.19)%、(16.89±4.19)%、(20.60±5.24)%、(29.40±2.05)%、(35.38±1.70)%;48 h后的細胞增殖抑制率分別為:(8.30±3.48)%、(14.20±3.76)%、(22.10±6.10)%、(31.20±2.03)%、(42.33±2.17)%、(49.58±1.84)%;72 h后的細胞增殖抑制率分別為:(19.02±2.67)%、(22.13±6.11)%、(25.83±2.69)%、(36.65±6.30)%、(49.67±3.80)%、(53.70±3.13)%。這些結(jié)果表明,相比于對照組,二甲雙胍能夠明顯抑制PANC-1細胞的增殖,并且其抑制作用隨著二甲雙胍劑量的增加和干預(yù)時間的延長而逐漸增強。計算后得到二甲雙胍的最適干預(yù)時間是48 h,IC50值約為20 mmol/L。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn),每個實驗組的細胞增殖抑制率與對照組之間均有差異,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。2.胰腺癌細胞Western Blot結(jié)果顯示:使用濃度分別為2,5,10,15,20mmol/L的二甲雙胍干預(yù)胰腺癌PANC-1細胞后,細胞中ALDH1和p-mTOR蛋白表達隨著二甲雙胍濃度的增加均呈下降趨勢,并且呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴性。在作用機制的研究結(jié)果中顯示:二甲雙胍以及雷帕霉素組均能夠明顯降低ALDH1,4EBP1以及p-mTOR的蛋白水平;聯(lián)合用藥組的抑制作用會更顯著。二甲雙胍對ALDH1的蛋白表達的抑制作用要明顯強于雷帕霉素,其兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);然而二甲雙胍對PANC-1細胞中4EBP1以及p-mTOR的表達與雷帕霉素相比較未見顯著變化。3.q RT-PCR結(jié)果:相比于對照組,二甲雙胍以及雷帕霉素明顯抑制胰腺癌PANC-1細胞中ALDH1,4EBP1以及p-mTOR m RNA的轉(zhuǎn)錄水平;然而,二甲雙胍對PANC-1中ALDH1的表達的抑制作用明顯強于雷帕霉素,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.免疫熒光法結(jié)果示:相比于對照組,二甲雙胍組能夠明顯降低ALDH1的表達,雷帕霉素也有類似的作用。5.成球?qū)嶒灥慕Y(jié)果顯示:對照組胰腺癌PANC-1的細胞球數(shù)為85.00±5.12,二甲雙胍干預(yù)后的細胞球數(shù)為43.00±3.66,雷帕霉素干預(yù)后細胞球數(shù)為55.00±3.21。我們使用Western Blot的方法檢測二甲雙胍針對胰腺癌細胞球中ALDH1蛋白表達的作用時發(fā)現(xiàn):相對于胰腺癌細胞系中ALDH1的表達水平,胰腺癌細胞球ALDH1的表達明顯增高;在使用二甲雙胍和雷帕霉素干預(yù)胰腺癌細胞球后發(fā)現(xiàn):相比于對照組,二甲雙胍以及雷帕霉素組均能夠抑制ALDH1蛋白的表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6.成瘤能力的比較結(jié)果顯示:胰腺癌PANC-1細胞的成瘤能力(7/10)明顯低于胰腺癌細胞球的成瘤能力(10/10)。不僅如此,胰腺癌細胞球接種后形成的腫瘤體積要顯著大于胰腺癌PANC-1細胞,且兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.二甲雙胍顯著抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖能力以及ALDH1的表達,并且隨著二甲雙胍劑量的增加和干預(yù)時間的延長,抑制作用越明顯。2.二甲雙胍以及雷帕霉素均能夠抑制胰腺癌PANC-1細胞中ALDH1的表達,其機制可能是通過mTOR通路。3.二甲雙胍以及雷帕霉素均能夠抑制胰腺癌PANC-1細胞球的形成,還能夠抑制胰腺癌成球細胞中ALDH1的表達,其機制可能是通過mTOR通路。
[Abstract]:Background According to the U.S. Cancer Survey, the number of new cancer cases in 2016 was 1,685,210, equivalent to about 4,600 people diagnosed as malignant tumors per day. Surgery is still considered the most effective treatment for pancreatic cancer, but even after aggressive treatment, the 5-year survival rate is only 25%-35%. Aldehyde dehydrogenases (ALDHs) have been found to be highly expressed in pancreatic cancer in recent years, and are closely related to the characteristics of pancreatic cancer stem cells. Metformin is one of the most widely used oral antidiabetic drugs in the world. It can be used to identify and isolate pancreatic cancer stem cells (CSCs). A retrospective study found that metformin could reduce cancer morbidity and mortality in diabetic patients. In addition, other studies have found that metformin can pass not only mammalian rapamycin target protein (ma). The mmalian Target of Rapamycin (mTOR) pathway inhibits the proliferation of pancreatic cancer cells and the expression of ALDH1 in pancreatic cancer animal models, but its mechanism is not clear. Objective To investigate the effect of metformin on the expression of ALDH1 in pancreatic cancer PANC-1 cells and pancreatic cancer stem cells and the relationship between the expression of ALDH1 and mTOR. The effects of metformin on the proliferation of PANC-1 cells and the expression of ALDH 1 and p-mTOR proteins were measured by Western Blot, Immunofluorescence and Quantitative real-time PCR (q RT-PCR). The expression of ALDH1, 4EBP1, p-mTOR protein and m RNA in PANC-1 cells was detected by Western Blot assay. Pancreatic cancer cells were cultured in suspension with ultra-low adhesion plate to observe the effect of different drugs on the ability of pancreatic cancer cells to globe. Results 1. CCK-8 Results: The inhibitory rates of proliferation of PANC-1 cells treated with metformin at concentrations of 1,2,5,10,15 and 20 mmol/L after 24 hours were (5.23+2.03)%, (10.23+4.19)%, (16.89+4.19)%, (20.60+5.24)%, (20.60+5.24)% respectively. 29.40 [(29.40 [(2.05)%, (35.38 [(1.70)%, (35.38 [1.70)%, (35.38 [1.70)%; (8.30 [3.48)%, (14.20 [3.76)%, (14.20 [(14.20 [3.766.76)%, (22.10 [22.10 [6.10 [(22.10 [6.10)%, (31.20 [(31.20 [2.20 [2.03)%, (42.33 [2.22.33 [2.17 [2.17 [(49.58 [1.58 [1.84)%, (49.58 80%, (53.70+3.13)%. These knots The results showed that metformin significantly inhibited the proliferation of PANC-1 cells compared with the control group, and the inhibitory effect increased with the increase of metformin dose and the prolongation of intervention time. The results of Western Blot showed that the expression of ALDH 1 and p-mTOR protein in pancreatic cancer PANC-1 cells increased with the concentration of metformin after the intervention of metformin at 2,5,10,15,20 mmol/L, respectively. Metformin and rapamycin could significantly reduce the levels of ALDH1, 4EBP1 and p-mTOR, and the inhibitory effect of metformin on the expression of ALDH1 was stronger than that of Ray. However, the expression of 4EBP1 and p-mTOR in PANC-1 cells was not significantly changed by metformin compared with rapamycin. 3. Q RT-PCR results: Compared with the control group, metformin and rapamycin significantly inhibited the expression of ALDH1, 4EBP1 and p-mTOR m RNA in PANC-1 cells. However, the inhibitory effect of metformin on the expression of ALDH1 in PANC-1 was significantly stronger than that of rapamycin, and the difference was statistically significant (P 0.05). 4. Immunofluorescence assay showed that metformin significantly decreased the expression of ALDH1 compared with the control group, and rapamycin had a similar effect. 5 In the control group, the number of PANC-1 globules was 85.00 (+ 5.12), 43.00 (+ 3.66) after metformin treatment, and 55.00 (+ 3.21) after rapamycin treatment. Compared with the control group, metformin and rapamycin could inhibit the expression of ALDH1 protein, and the difference was statistically significant (P 0.05). The tumor-forming ability of PANC-1 cells (7/10) was significantly lower than that of pancreatic cancer cells (10/10). Moreover, the tumor volume of PANC-1 cells inoculated with pancreatic cancer cells was significantly larger than that of PANC-1 cells, and the difference was statistically significant (P 0.05). Conclusion 1. Metformin significantly inhibited the proliferation of pancreatic cancer PANC-1 cells. Metformin and rapamycin can inhibit the expression of ALDH 1 in pancreatic cancer PANC-1 cells, which may be through the mTOR pathway. 3. Metformin and rapamycin can inhibit the globules of pancreatic cancer PANC-1 cells. It can also inhibit the expression of ALDH1 in pancreatic cancer spheroid cells. The mechanism may be through the mTOR pathway.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.9

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本文編號：2211939