【摘要】：目的:探討慢病毒介導(dǎo)的生長抑制因子ING4過表達對乳腺癌細胞遷移、侵襲的作用及其機制。方法:(1)以攜帶人源化ING4編碼序列(CDS)的pAdTrack-CMV/ING4質(zhì)粒為模板,利用ING4特異性引物(ING4-F:5'-gaa gct agc gcc acc atg gct gct ggg atg tat ttg-3';ING4-R:5'-ata ggc gcg ccc tat ttc ttc ttc cgt tct tg-3')通過PCR擴增獲得ING4 CDS片段。(2)在GFP標記的p Lenti6.3/IRES/GFP慢病毒質(zhì)粒的NheI和Sgs I限制性酶切位點之間插入ING4目的片段構(gòu)建ING4重組慢病毒質(zhì)粒pLenti6.3/ING4/IRES/GFP,并通過PCR、雙酶切、DNA測序鑒定。(3)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將構(gòu)建正確的pLenti6.3/ING4/IRES/GFP及其對照pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒質(zhì)粒分別與輔助包裝質(zhì)粒pLP1、p LP2、VSVG共轉(zhuǎn)染293T人胚腎細胞包裝GFP標記的ING4重組慢病毒(LV-ING4)及其對照空病毒(LV),并將慢病毒培養(yǎng)上清高速離心濃縮后,用有限稀釋法根據(jù)GFP的表達進行滴度測定。(4)LV-ING4、LV分別用10MOI的最佳感染劑量感染MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞,通過10μg/ml的滅瘟素(BSD)篩選后獲得MDA-MB-468-LV-ING4(簡寫為MDA-MB-468-ING4)、MDA-MB-468-LV(簡寫為MDA-MB-468-Mock)。熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測GFP分析轉(zhuǎn)基因效率,及RT-PCR、Western blot檢測慢病毒介導(dǎo)ING4在MDA-MB-468細胞中的表達。(5)采用Transwell遷移、侵襲實驗檢測MDA-MB-468-ING4、MDA-MB-468-Mock乳腺癌細胞的遷移、侵襲能力,分析慢病毒介導(dǎo)的ING4過表達對MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞遷移、侵襲的作用。(6)利用Western blot檢測MDA-MB-468-ING4、MDA-MB-468-Mock乳腺癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Snail2、Zeb1、Zeb2、Twist1、Twist2)的表達,分析慢病毒介導(dǎo)的ING4過表達抑制MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞遷移、侵襲的分子機制。結(jié)果:(1)成功制備了表達人源化ING4的GFP標記重組慢病毒(LV-ING4)。(2)成功構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的ING4轉(zhuǎn)基因MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞。(3)慢病毒介導(dǎo)的ING4過表達能夠明顯抑制MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞的遷移、侵襲能力,MDA-MB-468-ING4較MDA-MB-468-Mock的相對遷移、侵襲力分別為45.7%、36.8%。(4)ING4能夠明顯下調(diào)MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞Snail1、Snail2 EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(EMT-TFs)和N-cadherin間充質(zhì)標志物及上調(diào)E-cadherin上皮標志物,而對Zeb1、Zeb2、Twist1、Twist2 EMT-TFs幾乎無影響。結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)的ING4過表達能夠下調(diào)Snail1、Snail2 EMT-TFs逆轉(zhuǎn)EMT的方式抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:Aim: to investigate the effect of lentivirus-mediated growth suppressor ING4 overexpression on the migration and invasion of breast cancer cells and its mechanism. Methods: (1) pAdTrack-CMV/ING4 plasmid carrying humanized ING4 coding sequence (CDS) was used as template. ING4 CDS fragments were obtained by PCR amplification using ING4 specific primers (ING4-F:5'-gaa gct agc gcc acc atg gct ggg atg tat ttg-3 (ING4-F:5'-gaa gct agc gcc acc atg gct ggg atg tat ttg-3) ING4-R: 5a ggc gcg ccc tat ttc cgt tct tg-3'). (2) inserted between NheI and Sgs I restriction endonuclease sites of GFP labeled pLenti6.3/IRES/GFP lentivirus plasmids. The ING4 recombinant lentivirus plasmid pLenti6.3 / ING4 / IRES- / GFP was constructed by ING4 target fragment, and identified by PCR and double enzyme digestion. (3) the constructed lentivirus plasmid and its control pLenti6.3/IRES/GFP lentivirus plasmid were cotransfected into 293T human embryo kidney by liposome Lipofectamine2000 and co-transfected with pLP1pLP2VSVG, respectively. Cell packaging GFP labeled ING4 recombinant lentivirus (LV-ING4) and its control empty virus (LV), and culturing lentivirus supernatant with high speed centrifugation and concentration. The titer of LV-ING4LV was determined by limited dilution method according to GFP expression. (4) LV-ING4LV was infected with MDA-MB-468 tri-negative breast cancer cells with the best infection dose of 10MOI, and MDA-MB-468-LV-ING4 (MDA-MB-468-ING4) MDA-MB-468-LV (MDA-MB-468-Mock) was obtained by 10 渭 g/ml (BSD) screening. Fluorescence microscopy, flow cytometry and RT-PCR Western blot were used to detect the expression of ING4 mediated by lentivirus in MDA-MB-468 cells. (5) Transwell migration and invasion assay were used to detect the migration and invasion ability of MDA-MB-468-MNG4MDA-MB-468-Mock breast cancer cells. To analyze the effect of lentivirus-mediated overexpression of ING4 on the migration and invasion of MDA-MB-468 tri-negative breast cancer cells. (6) Western blot was used to detect the expression of E-cadherin N-cadherin Snail2Zeb2Zeb2Zeb2Zeb2Zeb2Twist1 Twist2 protein in MDA-MB-468-Mock breast cancer cells. To analyze the molecular mechanism of lentivirus-mediated overexpression of ING4 inhibiting the migration and invasion of MDA-MB-468 tri-negative breast cancer cells. Results: (1) GFP labeled lentivirus (LV-ING4). (2) expressing human ING4 was successfully prepared to construct ING4 transgene MDA-MB-468 triple negative breast cancer cells mediated by lentivirus. (3) Lentivirus mediated ING4 overexpression could significantly inhibit MDA-MB-468 triple negative breast cancer cells. The migration of adenocarcinoma cells, The invasion ability of MDA-MB-468-ING4 was 45.7 and 36.8than that of MDA-MB-468-Mock, respectively. (4) ING4 could significantly down-regulate EMT-TFs and N-cadherin mesenchymal markers and up-regulate E-cadherin epithelial markers in MDA-MB-468 tri-negative breast cancer cells, but had little effect on Zeb1Twist1Twist2 EMT-TFs. Conclusion: lentivirus-mediated overexpression of ING4 can inhibit the metastasis of breast cancer by down-regulating Snail1 and Snail2 EMT-TFs reversing EMT.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2196844