【摘要】：目的檢測DKK2在乳腺中的表達(dá)情況及甲基化程度,并說明其在乳腺癌中的生物學(xué)作用以及相關(guān)機(jī)制。為乳腺癌的早期診斷及預(yù)后提供有效的生物標(biāo)志物。方法通過半定量PCR和real-time PCR方法,分別檢測DKK2在乳腺癌細(xì)胞及組織中表達(dá)的情況。運(yùn)用MSP測定DKK2在乳腺細(xì)胞及組織中的甲基化情況。通過去甲基化藥物處理乳腺癌細(xì)胞后檢測DKK2的表達(dá)情況。將DKK2過表達(dá)質(zhì)粒感染乳腺癌細(xì)胞株MB231、MCF7(DKK2表達(dá)缺失)。運(yùn)用克隆形成、CCK8、Transwell、Woundhealing、AO\EB、流式、血管形成等實驗,分別檢測DKK2對增殖、轉(zhuǎn)移、周期和凋亡及腫瘤血管形成的作用。通過westernblot及免疫熒光檢測Wnt信號通路及EMT相關(guān)分子指標(biāo)。同時通過PCR方法檢測DKK2對腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響。最后通過裸鼠實驗檢測DKK2在體內(nèi)抑癌作用。結(jié)果DKK2在8種乳腺癌細(xì)胞系中均低表達(dá),同時在乳腺癌細(xì)胞及組織中都存在DKK2啟動子高甲基化狀態(tài),而在正常乳腺組織中甲基化狀態(tài)明顯較低。運(yùn)用去甲基化藥物DKK2沉默的乳腺癌細(xì)胞能重新表達(dá)DKK2。過表達(dá)DKK2后,MB231、MCF7細(xì)胞的增殖、遷移及血管形成的能力明顯降低,細(xì)胞阻滯并誘導(dǎo)凋亡。同時,過表達(dá)DKK2后可部分逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生,明顯下調(diào)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。通過體內(nèi)裸鼠成瘤實驗顯示DKK2可明顯抑制乳腺癌的生長。此外,DKK2主要通過下調(diào)Wnt信號通路的激活來發(fā)揮作用。結(jié)論在乳腺癌中DKK2因甲基化而失活。我們的研究有助于闡明,在乳腺癌中DKK2通過對Wnt信號通路的調(diào)節(jié)作用從而對其生物學(xué)行為有明顯的抑制作用,也許可以為乳腺癌患者的診斷、治療提供新的策略。
[Abstract]:Objective to detect the expression and methylation of DKK2 in breast cancer and to elucidate its biological role and related mechanism. To provide effective biomarkers for early diagnosis and prognosis of breast cancer. Methods semi-quantitative PCR and real-time PCR were used to detect the expression of DKK2 in breast cancer cells and tissues. The methylation of DKK2 in breast cells and tissues was determined by MSP. The expression of DKK2 in breast cancer cells was detected after treatment with demethylated drugs. DKK2 overexpression plasmid was infused into breast cancer cell line MB231 MCF7 (loss of DKK2 expression). The effects of DKK2 on proliferation, metastasis, cell cycle, apoptosis and tumor angiogenesis were detected by clone formation CCK8 Transwelling Woundhealing AO, flow and angiogenesis. Wnt signaling pathway and EMT related molecular indexes were detected by westernblot and immunofluorescence. At the same time, the effect of DKK2 on the expression of tumor stem cell markers was detected by PCR method. Finally, the inhibitory effect of DKK2 on cancer in vivo was detected by nude mice experiment. Results the expression of DKK2 was low in 8 breast cancer cell lines, and the hypermethylation of DKK2 promoter was found in both breast cancer cells and tissues, but the methylation state was significantly lower in normal breast tissues. Breast cancer cells silenced by demethylating drug DKK2 can reexpress DKK2. After overexpression of DKK2, the proliferation, migration and angiogenesis of MCF7 cells were significantly decreased, and the cells blocked and induced apoptosis. At the same time, overexpression of DKK2 could partially reverse the occurrence of EMT and significantly down-regulate the expression of tumor stem cell markers. In vivo tumorigenesis in nude mice showed that DKK2 could significantly inhibit the growth of breast cancer. In addition, DKK 2 plays an important role by down-regulating the activation of Wnt signaling pathway. Conclusion DKK2 is inactivated by methylation in breast cancer. Our study is helpful to clarify that DKK2 can inhibit the biological behavior of breast cancer by regulating the Wnt signaling pathway, which may provide a new strategy for the diagnosis and treatment of breast cancer patients.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：2188303