【摘要】：Micro RNAs(mi RNAs)參與細(xì)胞生長(zhǎng)的一系列重要進(jìn)程,包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡及死亡等過(guò)程。mi RNAs表達(dá)失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)、增殖及分化,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展,因此,其作為一種潛在的新型核酸類腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)具有廣闊的臨床應(yīng)用前景�，F(xiàn)有mi RNA檢測(cè)方法主要有RT-PCR,微陣列芯片及Northern blot等,雖然這些方法都有一定的優(yōu)勢(shì),但也存在一些不足,如操作繁瑣,費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏度低等,這些都會(huì)在很大程度上影響其臨床實(shí)用性。因此,發(fā)展簡(jiǎn)單、實(shí)用、快速、靈敏的mi RNAs檢測(cè)技術(shù)對(duì)于闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,尋找新的腫瘤標(biāo)志物,腫瘤的早期診斷和治療,探尋新的腫瘤治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值;有助于實(shí)現(xiàn)mi RNAs標(biāo)志物在腫瘤臨床診療中的應(yīng)用。本論文整合分子生物學(xué)、臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)及生物分析化學(xué)等學(xué)科的最新研究成果,基于功能核酸、DNA自組裝和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等,構(gòu)建兩種新穎、簡(jiǎn)單、快速的mi RNAs傳感檢測(cè)新方法,為腫瘤標(biāo)志物的早期診斷與治療提供潛在的檢測(cè)平臺(tái)。本研究主要包括以下兩個(gè)部分:1.核酸信號(hào)放大策略用于mi RNA的比色傳感整合鏈替代聚合反應(yīng)和啞鈴狀密封探針介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增雙重信號(hào)放大策略,本研究構(gòu)建了一個(gè)快速、免標(biāo)記的比色傳感器用于mi RNA的高靈敏、高特異性檢測(cè)。該傳感器主要包括4個(gè)組成部分,分別是由trigger模板、C-rich DNA修飾的MB,啞鈴狀滾環(huán)模板,剪切酶以及聚合酶。靶mi RNA引發(fā)鏈替代聚合反應(yīng),釋放滾環(huán)模板引物以啟動(dòng)基于toehold的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng),從而擴(kuò)增出大量富G的DNA(GDNA)序列;GDNA序列與Hemin結(jié)合形成DNAzyme催化ABTS2-和H2O2進(jìn)行比色反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)mi RNAs的高靈敏、高特異性檢測(cè)。該方法檢測(cè)限低至10 a M,檢測(cè)線性范圍為10 a M~1 n M,能很好的應(yīng)用于實(shí)際樣本的檢測(cè)。本章所構(gòu)建的mi RNA超靈敏檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、實(shí)用,有望成為腫瘤相關(guān)核酸標(biāo)志物的篩選、臨床診斷應(yīng)用的有力工具。2.新型DNA納米鑷的設(shè)計(jì)及其多組份miRNA的同時(shí)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)本方法構(gòu)建了一種基于靶物質(zhì)誘導(dǎo)納米結(jié)構(gòu)變化的新型DNA納米鑷,通過(guò)結(jié)合催化莖環(huán)自組裝(CHA)和鄰位觸及形成辣根過(guò)氧化物酶模擬酶(DNAzyme),實(shí)現(xiàn)了AND邏輯門(mén)操作和對(duì)多組份mi RNA的同時(shí)檢測(cè)。本研究構(gòu)建的基于DX(DNA double crossover,DX)模塊的DNA納米鑷的包含有信號(hào)輸入和信號(hào)輸出結(jié)構(gòu),兩臂中間含弓形結(jié)構(gòu)的DNA雙股螺旋作為信號(hào)輸入的識(shí)別域,用于同時(shí)特異性甄別兩種不同的靶物質(zhì);兩臂末端的拆分富G序列用于信號(hào)輸出。利用CHA信號(hào)放大策略,少量的靶物質(zhì)輸入可以靶向誘導(dǎo)大量的DNA納米鑷有打開(kāi)狀態(tài)轉(zhuǎn)向閉合狀態(tài),在Hemin存在時(shí),鑷兩臂末端的拆分富G序列在鄰位觸及作用下形成大量DNAzyme,從而產(chǎn)生放大的傳感輸出信號(hào)。兩種靶物質(zhì)通過(guò)AND邏輯門(mén)誘導(dǎo)調(diào)控DNA納米鑷的開(kāi)關(guān),通過(guò)聚丙烯酰胺電泳(PAGE)、表面等離子體共振(SPR)表征了該調(diào)控機(jī)制,證實(shí)新型DNA納米鑷構(gòu)建成功。構(gòu)建的生物傳感系統(tǒng)在輸出的化學(xué)發(fā)光信號(hào)和輸入mi RNA之間呈良好的線性關(guān)系,檢測(cè)線達(dá)30 f M。該生物傳感器可用于復(fù)雜的生物樣本中mi RNA的檢測(cè)分析。本方法構(gòu)建了一個(gè)簡(jiǎn)單,可重復(fù)利用的生物傳感平臺(tái),該傳感平臺(tái)可用于邏輯門(mén)的構(gòu)建以及無(wú)酶的高靈敏高特異性的mi RNA檢測(cè)。
[Abstract]:Micro RNAs (mi RNAs) are involved in a series of important processes of cell growth, including cell proliferation, differentiation, apoptosis and death. Misexpression of MI RNAs will lead to excessive cell growth, proliferation and differentiation, leading to the occurrence and development of tumors. Therefore, mi RNAs are a potential new type of tumor markers and potential therapeutic targets. The existing methods for detecting microRNA include RT-PCR, microarray chip and Northern blot. Although these methods have some advantages, they also have some disadvantages, such as complicated operation, time-consuming, laborious and low sensitivity, which will greatly affect their clinical practicability. Rapid and sensitive detection of MI RNAs is of great value in elucidating the mechanism of tumorigenesis and development, searching for new tumor markers, early diagnosis and treatment of tumors, and searching for new therapeutic targets for tumors. It is helpful to realize the application of MI RNAs markers in clinical diagnosis and treatment of tumors. Based on functional nucleic acids, DNA self-assembly and isothermal amplification techniques, two novel, simple and fast methods for detecting mi RNAs are proposed, which provide a potential platform for early diagnosis and treatment of tumor markers. This study mainly includes the following two parts: 1. Nucleic acid messenger A fast, label-free colorimetric sensor for high sensitivity and high specificity detection of MI RNA was constructed. The sensor consists of four components, namely, trigg. Er template, C-rich DNA modified MB, dumbbell-shaped ring template, shearing enzyme and polymerase. Target mi RNA initiates chain substitution polymerization, releases roller template primers to initiate toehold-based ring-rolling amplification reaction, thereby amplifying a large number of G-rich DNA (GDNA) sequences; GDNA sequence combines with hemin to form DNA zyme catalyzed ABTS2-and H2O2 for colorimetric inversion. The detection limit of this method is as low as 10 a M, and the detection linear range is 10 a M~1 n M. This method can be well applied to the detection of real samples. Force tool. 2. Design of novel DNA nanotweezers and simultaneous chemiluminescence detection of multi-component microRNAs. A novel DNA nanotweezers based on target-induced nanostructure changes were constructed. By combining catalytic stem-ring self-assembly (CHA) and ortho-contact formation of horseradish peroxidase mimetic enzyme (DNA zyme), the AND logic gate operation was realized. In this study, DNA nanotweezers based on DX (DNA double crossover, DX) module consisted of signal input and signal output structures, and DNA double helix containing bow-shaped structure between two arms was used as the recognition domain of signal input for simultaneous specific screening of two different target substances. Using the CHA signal amplification strategy, a small amount of target material input can be targeted to induce a large number of DNA nanotweezers to turn to the closed state. In the presence of hemin, the splitting rich G sequences at the ends of the tweezers arm form a large number of DNA zymes under the action of adjacent touch, thus generating amplified sensing output signals. The novel DNA nanotweezers were successfully constructed by inducing and controlling the switch of DNA nanotweezers through the logic gate of AND. The mechanism was characterized by polyacrylamide electrophoresis (PAGE) and surface plasmon resonance (SPR). The biosensor system was constructed with a good linear relationship between the output chemiluminescence signal and the input mi RNA. The biosensor can be used for the detection and analysis of MI RNA in complex biological samples. A simple and reusable biosensor platform is constructed. The biosensor platform can be used for the construction of logic gates and the detection of MI RNA with high sensitivity and specificity without enzyme.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730;TP212.3

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本文編號(hào)：2185462