【摘要】：乳腺癌是迄今為止全球女性最常見的惡性腫瘤,2014年美國估計有232670例新病例確診為乳腺癌(占女性惡性腫瘤的29%),約有40000人死于乳腺癌(排在肺癌和支氣管癌之后),整體死亡率排名第二(死亡率15%),盡管早期診斷與早期治療能提高乳腺癌患者臨床治愈率,延長生存時間,但是乳腺癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移,尤其是肺轉(zhuǎn)移(確診為肺轉(zhuǎn)移后,乳腺癌患者的中位生存時間時間不超過2年)仍然是導致乳腺癌患者死亡的最主要原因,是目前臨床面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。因此,我們迫切需要明確乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的分子機制,尋找能準確預測乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的標志物。CD59是一種以糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨著于細胞膜表面的補體調(diào)節(jié)蛋白(Membrane complement regulatory protein,mCRP)蛋白,它的主要作用是通過抑制具有靶細胞殺傷效應(yīng)的補體膜攻擊復合物(Membrane attack complex,MAC)的形成,最終抑制補體的激活,保護宿主細胞免受補體的攻擊。近年來隨著對腫瘤免疫認識的不斷加深,許多研究已經(jīng)證實CD59在很多實體腫瘤中呈現(xiàn)高表達,它能幫助腫瘤細胞逃避補體的攻擊;研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞高表達的CD59可能與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而CD59在乳腺癌中的作用機制并不明確,因此深入探討CD59在乳腺癌細胞增殖、浸潤及侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用,揭示CD59對于乳腺癌肺轉(zhuǎn)移患者的預后作用,為臨床治療提供潛在的治療靶點,具有重要的理論和臨床價值。第一章CD59在乳腺癌高肺轉(zhuǎn)移潛能細胞中高表達,激活Akt/ERK信號通路本部分工作的主要目的是鑒定CD59在乳腺癌高肺轉(zhuǎn)移潛能細胞MDA-MB-231-HM中的表達與其在親代細胞MDA-MB-231中的表達差異,并且進一步分析CD59在MDA-MB-231-HM差異表達的可能機制,為下一步繼續(xù)探討CD59對乳腺癌細胞增殖、侵襲方面的影響,建立CD59移植瘤動物模型奠定理論基礎(chǔ)。首先,我們選擇了實驗室構(gòu)建的具有高肺轉(zhuǎn)移能力的MDA-MB-231-HM和其親代細胞MDA-MB-231,對MDA-MB-231-HM和MDA-MB-231進行蛋白質(zhì)印跡法檢測補體調(diào)節(jié)蛋白的表達,我們發(fā)現(xiàn):與MDA-MB-231相比,補體調(diào)節(jié)蛋白中只有CD59在MDA-MB-231-HM中的表達呈現(xiàn)有差異地增高,而補體調(diào)節(jié)蛋白中的CD46和CD55并沒有呈現(xiàn)出表達差異。流式細胞學檢測進一步證實了CD59在MDA-MB-231-HM中的表達較其在MDA-MB-231中的表達顯著增高(P0.05),而不是CD46和CD55;然后根據(jù)已知文獻報導和實驗室的前期工作,我們采用蛋白質(zhì)印跡法檢測導致CD59出現(xiàn)高表達的可能機制,有可能影響和調(diào)節(jié)CD59的細胞信號通路中的上、下游的細胞信號因子。我們首先研究了核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的Spl和核磷酸化水平的Spl,結(jié)果表明:NF-κB信號通路的Spl在這兩個細胞系之間沒有顯著差異。然而,另一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CREB磷酸化后在MDA-MB-231-HM中的表達較其在MDA-MB-231中的表達顯著增高,已經(jīng)證實:CREB可以通過磷酸化Akt和磷酸化ERK直接或間接地被磷酸化,所以我們進一步檢測了Akt和ERK以及它們的磷酸化后的水平,發(fā)現(xiàn)磷酸化Akt和磷酸化ERK在MDA-MB-231-HM中的表達較其在MDA-MB-231中的表達顯著增高。通過比較高、低(或無)轉(zhuǎn)移潛能細胞系、或者是比較原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的差別,運用蛋白質(zhì)組學的研究手段,比較蛋白質(zhì)在表達數(shù)量、表達位置和修飾狀態(tài)上的差異,以發(fā)現(xiàn)與病理改變有關(guān)的蛋白質(zhì)和疾病特異性蛋白質(zhì),是目前研究腫瘤轉(zhuǎn)移分子機制的主要思路。我們選用高肺轉(zhuǎn)移潛能的細胞系MDA-MB-231-HM和MDA-MB-231,運用蛋白質(zhì)印跡法和流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)在這兩組細胞系中,補體調(diào)節(jié)蛋白中只有CD59在MDA-MB-231-HM中呈現(xiàn)差異性高表達。CD59是補體系統(tǒng)這個大家族的一個成員,它的主要作用是在補體活化的終末階段,通過阻止具有靶細胞殺傷效應(yīng)的MAC的形成,從而在補體級聯(lián)反應(yīng)的終末期抑制補體的激活,是補體系統(tǒng)的"抑制蛋白"。除此之外,CD59還具有其他的補體非依賴性功能,包括參與T細胞的粘附及活化信號的轉(zhuǎn)導;通過酪氨酸激酶活化中性粒細胞;抑制腫瘤細胞凋亡,參與腫瘤新生血管形成;參與肢體組織的再生;并可作為腫瘤干細胞的生物標記物等。CD59的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制非常復雜,目前研究認為涉及很多途徑,我們的研究顯示CD59在MDA-MB-231-HM中高表達,同時伴隨著磷酸化Akt和磷酸化ERK的高表達。研究報導Akt和ERK在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的作用,由此我們推測CD59在MDA-MB-231-HM中的高表達可能與其高肺轉(zhuǎn)移能力有關(guān),而且可能由Akt和ERK信號通路的活化介導。第二章下調(diào)MDA-MB-231-HM中CD59的表達能抑制細胞增殖,減少肺轉(zhuǎn)移本部分工作的主要目的是探討CD59在MDA-MB-231-HM中對細胞增殖及轉(zhuǎn)移的影響,進一步分析CD59在乳腺癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用價值。我們采取了如下研究方案:(1)利用特定的小干擾siRNA下調(diào)C59的表達,我們設(shè)計了2套特異性shRNA,實驗組為231-HM-shCD59和231-HM-shCD59'(對照組相應(yīng)分別為231-HM-Vector和231-HM-Vector'),通過慢病毒包裝、細胞轉(zhuǎn)染及抗生素篩選等一系列步驟,構(gòu)建相對應(yīng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)shRNA的細胞株,利用蛋白質(zhì)印跡法驗證穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中CD59的表達。(2)采用CCK8法檢測下調(diào)CD59在調(diào)節(jié)細胞增殖方面的影響,同時建立兩組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的原位移植瘤動物模型,分別在雌性無胸腺的裸小鼠的左邊第四個乳腺脂肪墊植入兩組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞,監(jiān)測乳腺腫瘤的生長,第5周處死裸鼠,剝離乳腺腫瘤及肺臟,計量腫瘤的大小及重量,HE染色法檢測動物的肺臟組織。通過以上實驗方案,我們分別得到了以下結(jié)果和結(jié)論:(1)CD59在MDA-MB-231-HM-Vector中的表達與在MDA-MB-231-HM中的表達沒有顯著性的差異,然而CD59在MDA-MB-231-HM-shCD59細胞中的表達較其在MDA-MB-231-HM細胞中的表達顯著性地降低(P0.05),有統(tǒng)計學差異。結(jié)果顯示:插入的空白載體構(gòu)建的MDA-MB-231-HM-Vector沒有影響CD59的表達,插入的 shRNA載體構(gòu)建的MDA-MB-23 l-HM-shCD59 和MDA-MB-23 l-HM-shCD59'顯著下調(diào)CD59的表達,表明穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建成功。(2)CCK8實驗結(jié)果顯示:從細胞鋪板后第四天開始,231-HM-shCD59的細胞增長比231-HM-Vector明顯減慢,下調(diào)CD59的表達能顯著抑制腫瘤細胞的增殖(P0.01);(3)原位移植瘤模型中,實驗組荷瘤鼠的腫瘤的大小比對照組荷瘤鼠的腫瘤大小顯著性減小,相關(guān)的腫瘤重量顯示一致的結(jié)果(P0.01)。在HE染色切片動物的肺臟組織,我們發(fā)現(xiàn)對照組中10只動物有3只荷瘤鼠的肺臟組織中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移灶,而在實驗組中無裸鼠出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移,這些數(shù)據(jù)表明:下調(diào)CD59的表達,可以抑制乳腺癌細胞在體外和體內(nèi)的增殖,并進一步減少體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。通過特異性shRNA下調(diào)CD59的表達,我們意外地發(fā)現(xiàn)不論是體外實驗還是體內(nèi)實驗,MDA-MB-231-HM細胞的生長明顯被抑制。正如我們所期望的,下調(diào)MDA-MB-231-HM細胞CD59的表達,在原位移植瘤模型中顯著減少肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。這個結(jié)果充分說明CD59與MDA-MB-231-HM的高肺轉(zhuǎn)移能力有關(guān),證明我們前一步的設(shè)想是正確的。補體調(diào)節(jié)蛋白,尤其是CD59,可以保護腫瘤細胞免受補體的攻擊,促進腫瘤細胞得以生存,從而又可以阻礙以抗體介導的腫瘤免疫對腫瘤細胞的作用。此外,有研究報導CD59的高表達不僅可以保護乳腺癌細胞MCF-7免受補體介導的細胞溶解,而且還可以通過抑制BCL-2促進MCF-7細胞的增殖;相反,下調(diào)CD59還可以促進Fas和Caspase-3從而誘導細胞凋亡。我們的研究進一步證實了下調(diào)CD59的表達可以抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231-HM的增殖,減少裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。我們的結(jié)論是:MDA-MB-231-HM的高肺轉(zhuǎn)移能力與CD59的高表達有關(guān),下調(diào)CD59的表達能抑制乳腺癌MDA-MB-231-HM的增殖,降低肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。第三章高表達CD59的乳腺癌患者更容易出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移,預后更差本部分研究的主要目的是理論聯(lián)系臨床,探討CD59的表達與乳腺癌患者臨床特征之間的聯(lián)系以及對患者預后的可能影響,為此,我們采用免疫組織化學方法檢測了 120例臨床乳腺癌患者的CD59的表達水平,同時收集這些患者的臨床特征以及隨訪結(jié)果,卡方檢驗分析患者臨床特征與CD59表達水平的相關(guān)性,Cox比例風險模型分析CD59的預后價值。我們在臨床收集了 120例經(jīng)病理證實的乳腺癌患者,其中58例患者隨訪出現(xiàn)了肺轉(zhuǎn)移,62例患者隨訪沒有出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。所有患者均采用免疫組織化學方法(IHC)檢測CD59的表達水平,同時收集這些患者的臨床病理特征,包括:年齡,腫瘤大小,腫瘤組織學分級,淋巴結(jié)狀態(tài),有無脈管癌栓,雌激素受體狀態(tài)(ER),孕激素受體狀態(tài)(PR),表皮生長因子受體-2狀態(tài)(HER-2)。我們的研究結(jié)果表明:CD59的表達只與患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移事件呈現(xiàn)顯著性正相關(guān),有統(tǒng)計學意義(P=0.00l)。在這些患者中觀察到CD59表達高的患者呈現(xiàn)出更高比例的表現(xiàn)為HER-2缺失的狀態(tài);而CD59的表達與患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤組織學分級、淋巴結(jié)狀態(tài)、ER、PR、HER-2均無顯著性相關(guān)。在這120例乳腺癌患者中,隨訪出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的患者占48.3%(58/120),我們采用了邏輯回歸模型,進行了單變量和多變量分析去預測這些患者是否出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。單變量分析的結(jié)果顯示:肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生與患者的腫瘤大小、腫瘤組織學分級、ER、PR、HER-2均無顯著性相關(guān)(P0.05),而與患者的年齡,淋巴結(jié)狀態(tài),有無脈管癌栓以及CD59的表達呈現(xiàn)顯著性相關(guān)(P0.05)。當患者具有以下特征時更加傾向于容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移:年齡≤35歲、淋巴結(jié)陽性、有脈管癌栓、CD59高表達。多因素生存分析的結(jié)果顯示:患者的CD59的表達、淋巴結(jié)狀態(tài)、以及是否伴有脈管癌栓是預測患者出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的獨立預后因素(P值分別為0.041、0.032和0.008)。此外,我們應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析法分析CD59的表達與患者生存的關(guān)系,結(jié)果證明:CD59表達水平與患者無復發(fā)生存率呈現(xiàn)負相關(guān)性(P0.01),CD59的表達更高的患者與CD59的表達較低的患者相比,預后差。Madjd和Mikkel等曾經(jīng)報導:CD59的表達缺失提示乳腺癌患者更差的預后,CD59的表達水平與轉(zhuǎn)移能力呈現(xiàn)負相關(guān),而我們的研究表明CD59的高表達提示乳腺癌的預后差,CD59的表達水平與MDA-MB-231-HM細胞的生長與轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)正相關(guān)。在由Madjd報導的包含520名乳腺癌患者的臨床研究中,并沒有把肺轉(zhuǎn)移作為研究的變量參數(shù),然而我們專注于肺轉(zhuǎn)移并由此選擇了 120名乳腺癌患者,把患者區(qū)分為轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移兩組;此外在我們的研究中,CD59高表達的患者中有很大一部分屬于激素受體陰性,Her-2陰性的患者,這些差異可能會導致我們得出不同的結(jié)論。乳腺癌臨床治療中的復發(fā)風險評估中認為患者年齡≤35歲、淋巴結(jié)陽性、伴有脈管癌栓是復發(fā)的危險因素,我們的結(jié)果與之是一致的。Mikkel等的研究顯示:CD59是與轉(zhuǎn)移的侵襲性相關(guān),而不是與轉(zhuǎn)移的本身相關(guān);而在我們的研究中,下調(diào)CD59的表達能抑制裸鼠腫瘤的生長,減少肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生,這些可能是由于腫瘤細胞的生長受到抑制的原因引起。事實上已經(jīng)有研究報道CD59能通過Src的家族成員Lck介導T細胞的信號傳導,我們不能排除在乳腺癌細胞MDA-MB-231-HM中,可能通過CD59傳輸?shù)男盘柎龠M細胞增殖和轉(zhuǎn)移。作為一個生物標志物,CD59在乳腺癌中可能扮演著復雜的角色。由此,我們的研究最終證實:CD59的高表達是乳腺癌細胞MDA-MB-231-HM具有高肺轉(zhuǎn)移能力的重要原因,下調(diào)CD59的表達能顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231-HM的增殖,降低肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。臨床乳腺癌患者中CD59的高表達與肺轉(zhuǎn)移事件的發(fā)生呈正相關(guān)(P0.01),與患者無復發(fā)生存率呈現(xiàn)負相關(guān)性(P0.01)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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