【摘要】：目的:構(gòu)建多發(fā)性骨髓瘤骨病NOD/SCID小鼠模型,并探索富含半胱氨酸61(CCN1)在多發(fā)性骨髓瘤骨病(Myeloma bone disease,MBD)中的作用。研究唑來膦酸及其聯(lián)合硼替佐米抗骨髓瘤細胞RPMI-8226的機制。方法:第一部分多發(fā)性骨髓瘤骨病NOD/SCID小鼠模型的構(gòu)建。選取4-6周雌性NOD/SCID小鼠,向小鼠右側(cè)脛骨骨髓腔注射RPMI-8226細胞懸液(5x106/ml)15μl,左側(cè)注射相同體積PBS緩沖液15μl作為對照。按注射MM細胞后時間實驗組分為3周組、5周組、7周組。每組實驗動物為10只。分別通過X線及顯微CT檢測NOD/SCID小鼠骨質(zhì)破壞情況;ELISA方法檢測NOD/SCID小鼠外周血RPMI-8226分泌λ輕鏈含量;免疫組織化學染色檢測小鼠骨髓中細胞CD138表達情況;瑞氏染色檢測NOD/SCID小鼠脛骨骨髓中MM細胞,骨髓瘤細胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)檢測小鼠骨中破骨細胞情況。第二部分在構(gòu)建的多發(fā)性骨髓瘤骨病NOD/SCID小鼠模型中探索富含半胱氨酸蛋白61(CRY61/CCN1)在多發(fā)性骨髓瘤骨病中的作用。通過慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定上調(diào)富含半胱氨酸蛋白61(CRY61/CCN1)表達的RPMI-8226細胞,并采用以上建立的多發(fā)性骨髓瘤骨病NOD/SCID小鼠模型構(gòu)建方法,根據(jù)注射MM細胞類型分為RPMI-8226組、RPMI-8226/EV組、RPMI-8226/CCN1組,每組實驗動物為10只。注射細胞7周后通過顯微CT檢測NOD/SCID小鼠骨質(zhì)破壞情況;ELISA方法檢測NOD/SCID小鼠外周血RPMI-8226分泌λ輕鏈含量;免疫組織化學染色檢測小鼠骨髓中CD138表達情況;抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)檢測小鼠脛骨中破骨細胞情況。ELISA方法檢測MBD患者外周血中CCN1水平。研究對象為初治多發(fā)性骨髓瘤骨病患者25例,緩解組25例,以性別年齡相近的健康志愿者25名作為對照。第三部分唑來膦酸及其聯(lián)合硼替佐米抗骨髓瘤細胞RPMI-8226機制研究。研究不同濃度唑來膦酸及其聯(lián)合硼替佐米在24h及48h后對骨髓瘤細胞系RPMI-8226抑制作用及可能機制。采用CCK-8檢測細胞增殖狀況,流式細胞計數(shù)儀檢測細胞凋亡,細胞免疫熒光染色檢測pim-2在RPMI-8226細胞中的表達,實時定量PCR檢測檢測Pim-2、NF-κB在mRNA表達水平,蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Ras、AKT、pAKT以及NF-κB、Pim-2蛋白分子的表達。結(jié)果:第一部分X線檢測NOD/SCID小鼠右側(cè)脛骨注射多發(fā)性骨髓瘤細胞系rpmi-8226在3周、5周較兩組中各自正常對照脛骨(l)并無明顯差異;第7周可見右側(cè)脛骨較左側(cè)正常對照脛骨有明顯脛骨損傷。顯微ct檢測發(fā)現(xiàn),注射mm細胞后3周較正常對照脛骨未出現(xiàn)明顯骨質(zhì)破壞;注射mm細胞后5周與正常對照脛骨比較即可出現(xiàn)明顯骨質(zhì)破壞,注射mm細胞脛骨骨質(zhì)較注射pbs脛骨骨質(zhì)骨體積分數(shù)(totalbonevolume/totalvolume)(0.365±0.063)vs(0.549±0.057)明顯減低(p=0.022),注射mm細胞脛骨骨質(zhì)較注射pbs脛骨骨質(zhì)骨小梁體積(trabecularbonevolume)(1.104±0.077)vs(2.000±0.353)顯著減低(p=0.043),注射mm細胞脛骨骨質(zhì)較注射pbs脛骨骨質(zhì)骨小梁分離度(trabecularspacing)(0.137±0.003)vs(0.102±0.025)無顯著差別(p=0.072),但有增加趨勢;注射mm細胞后7周與正常對照組比較出現(xiàn)了明顯骨質(zhì)破壞,注射mm細胞脛骨骨質(zhì)較注射pbs脛骨骨質(zhì)骨體積分數(shù)(totalbonevolume/totalvolume)(0.322±0.061)vs(0.546±0.043)明顯減低(p=0.006),注射mm細胞脛骨骨質(zhì)較注射pbs脛骨骨質(zhì)骨小梁體積(trabecularbonevolume)(0.719±0.125)vs(2.007±0.424)顯著減低(p=0.007),注射mm細胞脛骨骨質(zhì)較注射pbs脛骨骨質(zhì)骨小梁分離度(trabecularspacing)(0.142±0.014)vs(0.096±0.014)顯著增高(p=0.008)。elisa檢測注射骨髓瘤細胞后3周血漿λ輕鏈含量輕鏈含量為(164.62±76.503)ng/ml,注射骨髓瘤細胞后5周血漿λ輕鏈含量為(611.93±131.484)ng/ml,注射骨髓瘤細胞后7周血漿λ輕鏈含量為(1308.91±251.584)ng/ml。各組差異均有有統(tǒng)計學意義(p0.05)。免疫組織化學染色在3周、5周、7周組注射了mm細胞的nod/scid實驗小鼠脛骨骨髓中cd138染色均出現(xiàn)陽性細胞染色。瑞氏染色發(fā)現(xiàn)nod/scid小鼠在注射mm細胞7周組中脛骨骨髓細胞中存在與細胞系rpmi-8826形態(tài)相同的骨髓瘤細胞�？咕剖崴嵝粤姿崦溉旧�(trap)發(fā)現(xiàn)注射mm細胞組中7周后出現(xiàn)了較正常對照組明顯的(trap)染色結(jié)果。第二部分慢病毒載體轉(zhuǎn)染prmi-8226細胞72h后,倒置熒光顯微鏡示慢病毒egfp綠色熒光在轉(zhuǎn)染細胞中表達,臺盼藍染色檢測rpmi-8226/ev組和rpmi-8226/ccn1組細胞存活率為別為89.74%、88.43%,westernblot檢測轉(zhuǎn)染慢病毒cyr61/ccn1載體能提高rpmi-8226細胞ccn1蛋白表達,轉(zhuǎn)染空病毒rpmi-8226/ev組中ccn1表達無明顯增加。將慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的rpmi-8226/ccn1組和rpmi-8226/ev組以及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的rpmi-8226細胞分3組分別注射到nod/scid小鼠脛骨骨髓腔內(nèi),7周后,通過檢測顯微ct示注射rpmi-8226細胞組及rpmi-8226/ev組均出現(xiàn)了明顯的骨質(zhì)破壞,rpmi-8226/ccn1組無明顯的骨質(zhì)破壞。注射rpmi-8226/ev細胞組脛骨骨質(zhì)較注射rpmi-8226/ccn1組脛骨骨質(zhì)骨體積分數(shù)(totalbonevolume/totalvolume)(0.276±0.103)vs(0.454±0.034)明顯減低(p=0.047),注射rpmi-8226/ev細胞組脛骨骨質(zhì)較注射rpmi-8226/ccn1組脛骨骨小梁厚度(trabecularthickness)(0.049±0.015)vs(0.078±0.004)明顯減低(p=0.03),注射rpmi-8226/ev細胞組脛骨骨質(zhì)較注射rpmi-8226/ccn1組脛骨質(zhì)骨小梁體積(trabecularbonevolume)(0.648±0.298)vs(1.754±0.169)顯著減低(p=0.005),注射rpmi-8226/ev細胞組脛骨骨質(zhì)較注射rpmi-8226/ccn1組脛骨骨小梁分離度(trabecularspacing)(0.132±0.027)vs(0.092±0.008)無顯著差別(p=0.068),但有增加趨勢;elisa法測初治mbd患者外周血上清液中ccn1(282.58±119.46)pg/ml明顯高于正常對照(202.12±41.53)pg/ml(p0.05),緩解組(363.68±121.12)pg/ml較初治組亦明顯升高(p0.05)。elisa檢測注射骨髓瘤細胞7周后rpmi-8226細胞組(n=10)λ輕鏈含量為(1308.91±251.584)ng/ml,rpmi-8226/ccn1細胞組(n=10)λ輕鏈含量為(569.54±146.513)ng/ml,rpmi-8226/ev細胞組(n=10)λ輕鏈含量為(1230.53±251.363)ng/ml,rpmi-8226/ccn1細胞組較rpmi-8226/ev細胞組小鼠血漿igλ顯著降低(p=0.001)。免疫組織化學染色分別檢測rpmi-8226細胞組、rpmi-8226/ccn1組和rpmi-8226/ev組nod/scid實驗小鼠注射瘤細胞脛骨骨髓中cd138染色均出現(xiàn)陽性細胞染色,抗酒石酸酸性磷酸酶染色(trap)檢測分別注射rpmi-8226細胞組及rpmi-8226/ev組nod/scid實驗小鼠脛骨中出現(xiàn)了明顯的trap染色陽性結(jié)果,而較rpmi-8226細胞組及rpmi-8226/ev組,rpmi-8226/ccn1組trap染色并未出現(xiàn)明顯陽性結(jié)果。第三部分cck-8檢測發(fā)現(xiàn):單用唑來膦酸組中,唑來膦酸濃度分別為25μm,50μm,100μm,500μm,和1000μm,作用24h后細胞增殖抑制率分別為19.84±10.425,21.86±6.958,30.54±4.651,42.29±5.965,47.15±9.939。作用48h后細胞增殖抑制率分別為31.77±6.041,33.17±5.909,34.60±4.716,41.21±5.427,45.03±3.500。唑來膦酸濃度為25μm,50μm時,對rpmi-8226細胞增殖抑制作用48h組明顯高于24h組,而在唑來膦酸濃度分別為100μm,500μm,1000μm時對rpmi-8226細胞增殖抑制作用48h組與24h組無顯著差異。唑來膦酸聯(lián)合硼替佐米的實驗中,發(fā)現(xiàn)硼替佐米(10nm)聯(lián)合唑來膦酸濃度在100μm,500μm,1000μm,作用24h時細胞增殖抑制率分別為47.24±9.316,44.37±7.124,49.87±11.797,與單用硼替佐米(10nm)組30.26±4.363比較有顯著差異;但硼替佐米(10nm)聯(lián)合唑來膦酸48h時與單用硼替佐米(10nm)組相比較無顯著差異。聯(lián)合組唑來膦酸濃度分別為100μm,500μm,1000μm時對rpmi-8226細胞增殖抑制作用48h組與24h組均無顯著差異。流式檢測細胞凋亡實驗中,藥物作用24h后,唑來膦酸(250μm)較空白對照組顯著增加(14.43±3.983)vs(1.83±0.503)(p=0.006),硼替佐米(b)10nm聯(lián)合唑來膦酸125μm、250μm時細胞凋亡率31.07±3.675,49.00±13.952,與單用硼替佐米(b)10nm(19.50±2.68)相比有顯著差異(p0.05)。在48h組中,唑來膦酸(250μm)較空白對照組顯著增加(35.33±7.059)vs(2.73±1.762)(p0.001),唑來膦酸125μm、250μm分別聯(lián)合硼替佐米時較單藥硼替佐米組對mm細胞凋亡作用無顯著差異(p0.05)。唑來膦酸聯(lián)合硼替佐米作用24h時,唑來膦酸無論是低濃度(125μm)還是高濃度(250μm)聯(lián)合組均顯示出較單藥硼替佐米更強的促進mm細胞凋亡的作用,而唑來膦酸聯(lián)合硼替佐米作用48h時未顯示出較單藥硼替佐米更強的mm細胞凋亡作用。細胞免疫熒光實驗示pim-2在rpmi-8226細胞中表達,主要分布在細胞漿內(nèi)。實時定量pcr檢測發(fā)現(xiàn)藥物作用24h后nf-κb,pim-2mrna水平在唑來膦酸250μm組中mrna水平較空白對照組顯著降低(p=0.0001,p=0.002),在唑來膦酸125μm組中較空白對照組有降低趨勢,但是差異無統(tǒng)計學意義(p=0.129,p=0.161);aktmrna水平在硼替佐米及唑來膦酸組中均無明顯差異;nf-κb,pim-2在硼替佐米聯(lián)合唑來膦酸125μm組中mrna水平較硼替佐米組顯著降低(p=0.001,p=0.015);在硼替佐米聯(lián)合唑來膦酸250μm組中較硼替佐米組顯著降低(p=0.0001,p=0.001);akt在硼替佐米及其聯(lián)合唑來膦酸組中均未見明顯差異。藥物作用48h后信號通路分子akt,nf-κb,pim-2在硼替佐米分別聯(lián)合唑來膦酸125um、250um組中mrna水平較硼替佐米組差異無統(tǒng)計學差別(p0.05)。蛋白免疫印跡(westernblot)顯示不同濃度nf-kb抑制劑(0μm,1μm,2.5μm,5μm,10μm)作用rpmi-8226細胞48h后,伴隨著nf-κb減低,pim-2分子表達也被抑制。唑來膦酸250μm組較空白對照組顯著降低ras、pakt以及nf-κb,pim-2蛋白水平。唑來膦酸125μm組較空白對照組未顯著降低ras、pAKT以及NF-κB,Pim-2蛋白水平。硼替佐米聯(lián)(10nM)合唑來膦酸(125μM、250μM)(24h)組均能顯著降低Ras、pAKT以及NF-κB,Pim-2蛋白表達水平。硼替佐米聯(lián)合唑來膦酸(125μM、250μM)(48h)組未能顯著降低Ras、pAKT、NF-Kb、pim-2分子。結(jié)論:通過注射RPMI-8226細胞到NOD/SCID小鼠脛骨骨髓腔內(nèi)能成功構(gòu)建用于多發(fā)性骨髓瘤骨病相關(guān)研究的骨病小鼠模型;注射MM細胞后7周能通過X線方法檢測到骨質(zhì)破壞,在注射MM細胞后5周時通過顯微CT能檢測到的骨質(zhì)破壞。故模型用于研究早期骨質(zhì)破壞相關(guān)研究;其骨質(zhì)破壞機制可能是注射的MM細胞導致NOD/SCID小鼠骨組織中破骨細胞數(shù)量增多及功能增強有關(guān)。CCN1在MBD初治組、緩解組患者中較正常人升高。多發(fā)性骨髓瘤骨病NOD/SCID小鼠模型中證實CCN1能在小鼠體內(nèi)降低MM瘤負荷,抑制MM骨質(zhì)破壞。唑來膦酸(250μM)及唑來磷酸(125μM,250μM)聯(lián)合硼替佐米(10nM)可通過NF-κB/Pim-2細胞細胞信號通路抑制MM細胞增殖。同時,Ras及pAkt分子也受到抑制。唑來磷酸(125μM,250μM)聯(lián)合硼替佐米(10nM)在24h組而不是48h組顯示出明顯的抗瘤作用,故據(jù)此推測唑來磷酸與硼替佐米在24h聯(lián)合使用降低MM患者瘤負荷發(fā)揮重要協(xié)同作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.3

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本文編號：2149999