【摘要】：背景與目的現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Nm23-H1還存在胞核表達(dá),而既往的研究都是以過表達(dá)或抑制胞漿Nm23-H1為研究手段,由于Nm23-H1本身缺乏核引導(dǎo)序列,其研究結(jié)果并不能真實反映或重復(fù)臨床中Nm23-H1以胞核定位為主的實際生物學(xué)效應(yīng)。因此,本研究通過構(gòu)建帶有核引導(dǎo)序列的Nm23-H1載體并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞以探討Nm23-H1從胞漿向胞核轉(zhuǎn)位對肺癌細(xì)胞增殖的影響。方法采用基因重組技術(shù)構(gòu)建帶核定位信號序列的p Lentis-CMV-NME1-IRES2-PURO慢病毒載體,酶切和測序鑒定正確后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后用Western blot和激光共聚焦檢測Nm23-H1蛋白的定位和表達(dá),用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。結(jié)果成功構(gòu)建了核內(nèi)定向表達(dá)Nm23-H1的慢病毒載體。轉(zhuǎn)染組在72 h、96 h和120 h時增殖率與空載體組相比均顯著升高(P0.000,1)。空載體組A549細(xì)胞在G0期/G1期所占比例為35.69%,高于轉(zhuǎn)染組的28.28%(t=1.461,P=0.217);而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在G2期/M期所占比例為58.7%,空載體組為31.30%(t=4.560,P=0.010)。結(jié)論 Nm23-H1在人肺腺癌A549細(xì)胞的核內(nèi)過表達(dá)使細(xì)胞主要分布在G2期/M期并促進了細(xì)胞的體外增殖。
[Abstract]:Background & AIM existing studies have found that Nm23-H1 still exists nuclear expression, but previous studies have been carried out by overexpression or inhibition of cytoplasmic Nm23-H1, due to the lack of nucleocapsid sequence in Nm23-H1 itself. The results can not truly reflect or repeat the actual biological effects of nuclear localization of Nm23-H1 in clinical practice. Therefore, we constructed a Nm23-H1 vector with nucleocapsid sequence and transfected A549 cells to investigate the effect of Nm23-H1 translocation from cytoplasm to nucleus on the proliferation of lung cancer cells. Methods the vector of p Lentis-CMV-NME1-IRES2-PURO lentivirus with nuclear localization signal sequence was constructed by gene recombination technique. After confirmed by restriction endonuclease digestion and sequencing, the localization and expression of Nm23-H1 protein were detected by Western blot and confocal laser scanning after stable transfection into A549 cells. CCK-8 assay was used to detect cell proliferation and flow cytometry was used to detect cell cycle changes. Results Lentivirus vector expressing Nm23-H1 in nucleus was successfully constructed. The proliferation rate of the transfected group was significantly higher than that of the blank vector group at 72 h and 120 h (P0.0001). The percentage of A549 cells in G _ 0 / G _ 1 phase was 35.699.It was higher than that in transfection group (28.28%), while the proportion of transfected A549 cells in G _ 2 / M phase was 58.7% and 31.30% in empty vector group (t _ (4.560) P _ (0.010). Conclusion overexpression of Nm23-H1 in the nucleus of human lung adenocarcinoma A549 cells makes the cells mainly distribute in G2 phase and promote the proliferation of A549 cells in vitro.
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心;
【基金】：國家自然科學(xué)基金面上項目(No.81272599)資助~~
【分類號】：R734.2

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本文編號：2148744