【摘要】：胰腺癌是比較常見的消化道惡性腫瘤,近年的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢,其診斷與治療都十分的困難,且手術治療的死亡率較高,五年生存率不足5%,是預后最差的惡性腫瘤之一,極大多數(shù)病人死于癌細胞的轉(zhuǎn)移。我們擬利用農(nóng)副產(chǎn)品牛血及大豆殘渣,通過計算機模擬胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化,篩選出抗胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移的功能性多肽。我們用計算機模擬胰蛋白酶/胃蛋白酶將牛血紅蛋白進行水解,產(chǎn)生一系列的多肽片段,再依據(jù)與Hsp90對接消耗的自由能的大小排序,得到消耗自由能最低的6個牛血肽序列。經(jīng)過劃痕愈傷實驗的篩選,四肽Asn-Phe-Gly-Lye(NFGK)對胰腺癌細胞MIAPaCa-2遷移的抑制有著比較可觀的潛力。Transwell實驗結果進一步證實了NFGK的抑制效果,同時,我們通過MTS實驗得知,NFGK對細胞的生長增殖沒有影響,即沒有細胞毒性。我們將NFGK的N端與熒光素FITC連接,用熒光示蹤的方法,查看NFGK在細胞中的分布情況,發(fā)現(xiàn)NFGK只出現(xiàn)細胞膜上。此外,利用Western-Blot檢測蛋白水平的變化,證明NFGK以濃度依賴的方式抑制細胞外分泌型Hsp90α及其下游的MMP-9,而對細胞內(nèi)的Hsp90及其客戶蛋白CDK4均無抑制作用。同樣地,我們利用劃痕愈傷實驗篩選出了效果相對最理想的大豆肽YPTSK,然后通過tranwell實驗證明了其確有抑制MIAPaCa-2細胞遷移和侵襲的作用,并且,經(jīng)MTS實驗確認其也無細胞毒性。與NFGK不同的是,熒光共聚焦定位顯示YPTSK進入了細胞,但不入核。而ATP酶活檢測實驗則證明YPTSK不是通過抑制Hsp90的N端ATP酶活來抑制胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移的,相應的,我們發(fā)現(xiàn)YPTSK也并不抑制細胞內(nèi)外Hsp90及其客戶蛋白的表達水平。反而,AKT和MMP家族蛋白的表達水平有所下降,且進一步的RT-PCR實驗中,我們證實YPTSK的確抑制了一些MMP家族蛋白的轉(zhuǎn)錄水平,如MMP-2、MMP-9。在本研究中,我們首次證明胰腺癌細胞MIAPaCa-2也會分泌Hsp90α到細胞外基質(zhì),從而行使其分子伴侶功能,影響其下游如MMP-9等蛋白的功能。我們還首次從牛血及大豆殘渣中提取出具有抗癌細胞轉(zhuǎn)移作用的四肽NFGK及五肽YPTSK,既解決了農(nóng)副產(chǎn)品重新利用的問題,減少了浪費,又為輔助治療胰腺癌的方案提供了新的策略。
[Abstract]:Pancreatic cancer is a common malignant tumor of digestive tract. In recent years, the morbidity and mortality of pancreatic cancer are increasing obviously. The diagnosis and treatment of pancreatic cancer are very difficult, and the mortality rate of surgical treatment is high. The five-year survival rate is less than 5%, and is one of the worst malignant tumors. Most patients die of cancer cell metastasis. Using bovine blood and soybean residue as agricultural by-product, the functional peptides against pancreatic cancer cell metastasis were screened by computer simulation of pepsin and trypsin digestion. The bovine hemoglobin was hydrolyzed by computer simulated trypsin / pepsin to produce a series of polypeptide fragments. According to the order of the free energy consumed by docking with Hsp90, six bovine blood peptide sequences with the lowest consumption of free energy were obtained. The inhibitory effect of tetrapeptide Asn-Phe-Gly-Lye (NFGK) on MIAPaCa-2 migration of pancreatic cancer cells was confirmed by the screening of scratch callus assay. The results of Transwell experiment further confirmed the inhibitory effect of NFGK. We know by MTS experiment that NFGK has no effect on cell growth and proliferation, that is, no cytotoxicity. The N-terminal of NFGK was connected with fluorescein FITC, and the distribution of NFGK in cells was examined by fluorescence tracer. It was found that NFGK only appeared on the cell membrane. In addition, the change of protein level detected by Western-Blot showed that NFGK inhibited exocrine Hsp90 偽 and its downstream MMP-9 in a concentration-dependent manner, but had no inhibitory effect on intracellular Hsp90 and its client protein CDK4. In the same way, the soybean peptide YPTSKK, which is the most effective soybean peptide, was screened by scratch callus test, and its inhibitory effect on the migration and invasion of MIAPaCa-2 cells was proved by tranwell assay. Moreover, the MTS assay confirmed that YPTSKK had no cytotoxicity. Unlike NFGK, fluorescent confocal localization showed that YPTSK entered the cell but not into the nucleus. ATP activity assay showed that YPTSK did not inhibit the metastasis of pancreatic cancer cells by inhibiting the N-terminal ATP activity of Hsp90. Accordingly, we found that YPTSK did not inhibit the expression of Hsp90 and its client proteins in and out of the cells. On the contrary, the expression of AKT and MMP family proteins decreased, and in further RT-PCR experiments, we confirmed that YPTSK did inhibit the transcription level of some MMP family proteins, such as MMP-2, MMP-9. In this study, we demonstrated for the first time that pancreatic cancer cells MIAPaCa-2 also secreted Hsp90 偽 into extracellular matrix, thus exercising its molecular chaperone function and affecting the function of downstream proteins such as MMP-9. We also extracted tetrapeptide NFGK and pentapeptide YPTSKfrom bovine blood and soybean residue for the first time, which not only solved the problem of reuse of agricultural and sideline products, but also provided a new strategy for adjuvant treatment of pancreatic cancer.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.9

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本文編號：2145099