【摘要】：結(jié)直腸癌是全球常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率及死亡率均居世界前列。盡管近年來結(jié)直腸癌在診斷技術(shù),內(nèi)鏡和影像學(xué)檢查以及多學(xué)科綜合治療等方面取得了巨大進(jìn)步,每年仍會(huì)造成數(shù)以百萬的患者死亡。結(jié)直腸癌在免疫分子學(xué)研究方面取得的巨大進(jìn)展提示腫瘤的免疫逃逸將成為結(jié)直腸癌治療的一個(gè)重要障礙。因此尋找新的生物標(biāo)記物對(duì)于發(fā)展結(jié)直腸癌的靶向治療至關(guān)重要。腫瘤的發(fā)生發(fā)展受腫瘤微環(huán)境中多種因素的調(diào)控。既有正常細(xì)胞惡變過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞功能及生長的內(nèi)源性因子,也包括調(diào)控腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的外源性因素如局部浸潤的免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞分泌的促炎因子及趨化因子等�；诿庖呶h(huán)境對(duì)腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的重要影響,大量研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞分泌的某些細(xì)胞因子可參與調(diào)節(jié)特定的免疫細(xì)胞亞群的局部浸潤。Galectin-9作為galectins家族的一員,廣泛分布于免疫系統(tǒng)組織(如脾臟,胸腺和外周血淋巴細(xì)胞)及內(nèi)胚層起源的組織中(如肝臟,小腸,胃和肺)。大量研究已經(jīng)證實(shí)galectin-9在腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的正常組織中表達(dá)存在差異。多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞上galectin-9的表達(dá)明顯低于他們的正常對(duì)照。例如,乳腺癌,肺癌,腎癌,腎上腺癌和前列腺癌細(xì)胞系中g(shù)alectin-9表達(dá)降低或缺如。對(duì)來自神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢的腫瘤細(xì)胞系而言,galectin-9表達(dá)的差異依賴于腫瘤細(xì)胞的亞型。Galectin-9通過多種機(jī)制,如介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞周期、粘附和轉(zhuǎn)移、血管生成和腫瘤免疫逃逸,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這提示該分子有望成為一種新的腫瘤預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記。然而,galectin-9在結(jié)腸癌中的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義卻知之甚少。淋巴細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中的重要組成成分,影響腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后。自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells, NK)是固有免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞之一。在CRC腫瘤組織中,大量浸潤的NK細(xì)胞與患者較好的臨床預(yù)后相關(guān)。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)盡管在結(jié)直腸癌腫瘤組織中NK細(xì)胞反應(yīng)性細(xì)胞因子水平較高,腫瘤組織中浸潤的NK細(xì)胞數(shù)目仍明顯低于鄰近正常組織。這提示結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的趨化因子不足以募集NK細(xì)胞至腫瘤組織。此外,研究顯示galectin-9能增加荷瘤小鼠腹膜滲出液中NK細(xì)胞的數(shù)目,提示galectin-9可能通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞募集參與腫瘤進(jìn)展。據(jù)此我們推測腫瘤組織中NK細(xì)胞浸潤數(shù)目減少可能與galectin-9表達(dá)水平的降低有關(guān)。肌動(dòng)蛋白骨架的重組在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程中是必不可少的。肌動(dòng)蛋白感知并整合化學(xué)和物理信號(hào)以控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。Rho GTPase家族蛋白通過與表面受體結(jié)合激活細(xì)胞骨架。Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì)多種細(xì)胞骨架相關(guān)活動(dòng)必不可少,如通過磷酸化下游基質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架,增加肌動(dòng)蛋白纖維的穩(wěn)定性以及產(chǎn)生肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白收縮性。先前研究證實(shí)galectin-8,作為與galectin-9相似的另一種半乳糖凝集素,能誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排。因此我們推測galectin-9可能通過該通路影響NK細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3, Tim-3),屬于Tim家族的一員,是galectin-9的主要受體之一。作為重要的調(diào)節(jié)因子,Tim-3在多種淋巴細(xì)胞和腫瘤中發(fā)揮重要作用。Tim-3可以通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)并影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)已有多個(gè)研究檢測腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平以及對(duì)腫瘤進(jìn)展及預(yù)后的影響。例如,PD-1(hi)Tim-3(+)T細(xì)胞與急性髓細(xì)胞白血病(Acute myelogenous leukemia, AML)患者移植后的白血病復(fù)發(fā)強(qiáng)烈相關(guān)。在腎細(xì)胞腎癌中,CD4+T細(xì)胞和CD8-T細(xì)胞上Tim-3表達(dá)顯著升高,且與較高的臨床分期相關(guān)。此外,在黑色素瘤和肺腺癌患者中,NK細(xì)胞上Tim-3表達(dá)上調(diào),且與疾病分期相關(guān)并預(yù)測較差的患者預(yù)后。然而到目前為止,CRC患者外周淋巴細(xì)胞亞群上Tim-3表達(dá)及臨床意義尚未完全闡明。本課題在已有研究的基礎(chǔ)上,利用免疫組化的方法深入探討galectin-9在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義,并分析了galectin-9表達(dá)與腫瘤組織中NK細(xì)胞浸潤的相關(guān)性。通過體外實(shí)驗(yàn)分析galectin-9是否通過Rho/ROCK1通路調(diào)節(jié)NK細(xì)胞趨化作用的機(jī)制。此外,我們還初步探討了galectin-9的受體Tim-3在CRC患者外周血淋巴細(xì)胞上的表達(dá)及臨床意義,以期進(jìn)一步補(bǔ)充galectin-9在結(jié)直腸癌中NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)及腫瘤進(jìn)展中的作用及機(jī)制。第1部分Galectin-9在結(jié)腸癌中的表達(dá)目的：檢測galectin-9在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)情況,并分析galectin-9表達(dá)的臨床意義。方法：1-患者入組：本研究回顧性納入在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院行手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者128例,并收集患者的基本信息,包括性別,年齡及基本臨床資料。其中,38例患者同時(shí)獲取了腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織,用以評(píng)估兩種組織中g(shù)alectin-9表達(dá)差異。90例患者獲取了完整的隨訪數(shù)據(jù)以用于生存分析。資深病理學(xué)醫(yī)師對(duì)患者的組織病理學(xué)特征進(jìn)行評(píng)估,并根據(jù)手術(shù)切除標(biāo)本的病理學(xué)結(jié)果進(jìn)行TNM分期。2.免疫組化評(píng)價(jià)galectin-9表達(dá)：我們用免疫組織化學(xué)染色的方法評(píng)估galectin-9表達(dá),其免疫組織化學(xué)結(jié)果是基于陽性細(xì)胞的百分比及染色強(qiáng)度評(píng)分的。表達(dá)強(qiáng)度用組織學(xué)評(píng)分(ΣPi)表示。在這個(gè)公式中,p代表galectin-9陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù),其中1%-10%記為1分,11%-50%記為2分,51%-80%記為3分,81%-100%記為4分。i代表galectin-9在組織中的染色強(qiáng)度：無染色記為0分；弱染色記為1分；中度染色記為2分；強(qiáng)染色記為3分。最終,ΣPi評(píng)分10-12記為強(qiáng)陽性(++++),7-0分記為中等陽性(++),4-6分記為輕微陽性(++),1-2分記為弱陽性(+),而0分為陰性(-)。 為了便于后期的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,我們根據(jù)染色評(píng)分的中位數(shù)進(jìn)行二級(jí)評(píng)分：-/+為低表達(dá)組；++/+++/++++為高表達(dá)組。結(jié)果：1-在128例結(jié)腸癌腫瘤患者腫瘤組織中,78.91%患者galectin-9表達(dá)陽性。通過對(duì)38例患者腫瘤及癌旁組織galectin-9染色結(jié)果評(píng)估,我們發(fā)現(xiàn)該分子主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞及正常腺上皮的胞漿,但是在細(xì)胞核及細(xì)胞膜上并無表達(dá)。結(jié)腸癌腫瘤組織中g(shù)alectin-9表達(dá)明顯低于正常黏膜組織(p0.001)。2.結(jié)腸癌患者腫瘤組織中g(shù)alectin-9表達(dá)與TNM分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分化程度相關(guān),但是與性別,年齡及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。3. Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)galectin-9表達(dá)水平較高的患者其中位生存時(shí)間明顯高于galectin-9低表達(dá)患者(p=0.012)；此外,TNM分期(Ⅰ/Ⅱ)和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N-)患者也有較好的生存。4.單因素和多因素COX分析結(jié)果提示結(jié)腸癌腫瘤組織中g(shù)alectin-9表達(dá)是患者總生存的陽性預(yù)測因子。結(jié)論：Galectin-9在結(jié)腸癌腫瘤組織中表達(dá)降低,并且提示患者較差的預(yù)后。Galectin-9可作為結(jié)腸癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子。第二部分Galectin-9調(diào)節(jié)NK細(xì)胞浸潤及機(jī)制研究目的：檢測CD56+NK細(xì)胞在結(jié)腸癌腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的浸潤特點(diǎn),并分析galectin-9表達(dá)與NK細(xì)胞浸潤之間是否存在相關(guān)性。此外,探索galectin-9調(diào)節(jié)NK細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)及作用機(jī)制。方法：1.免疫組化：對(duì)38例結(jié)腸癌患者腫瘤組織及癌旁組織中CD56+NK細(xì)胞的浸潤數(shù)目進(jìn)行評(píng)估,分析NK細(xì)胞的浸潤特點(diǎn)及與galectin-9表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)性；對(duì)于CD56染色結(jié)果,我們在每個(gè)組織標(biāo)本中選取10個(gè)以上高倍鏡視野(200x)以評(píng)估CD56+NK細(xì)胞的浸潤強(qiáng)度。其中,選擇5個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤最密集的部位,計(jì)算腫瘤組織或癌旁正常大腸腺體附近浸潤的CD56+細(xì)胞數(shù)目。取每高倍視野下NK細(xì)胞平均數(shù)用以后期統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。我們根據(jù)四分位法將患者分為NK細(xì)胞浸潤陰性,低度浸潤,中度浸潤和高度浸潤組,用斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)用于分析galectin-9表達(dá)與NK細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性。2. SiRNA轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞：通過脂質(zhì)體Lipo 2000將siRNA-galectin-9及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染入CRC細(xì)胞系HT29中,同時(shí)用RT-PCR,免疫印記和ELISA檢測轉(zhuǎn)染效率；收集腫瘤培養(yǎng)上清。3.趨化實(shí)驗(yàn)：NK92細(xì)胞置于Transwell小室上層,下層則加入不同濃度的重組galectin-9或腫瘤培養(yǎng)上清。37℃培養(yǎng)4h,收集下室的細(xì)胞計(jì)數(shù)。此外,加入Y-27632和C3轉(zhuǎn)移酶以檢測Rho/ROCK信號(hào)通路在NK遷移中的作用。4. F-actin共聚焦成像：用重組galectin-9處理NK92細(xì)胞4h,行鬼筆環(huán)肽染色,通過使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察galectin-9對(duì)NK92細(xì)胞中F-actin極化的影響。結(jié)果：1.結(jié)腸癌癌旁組織中CD56+NK細(xì)胞浸潤明顯高于腫瘤組織p0.001)。此外,galectin-9高表達(dá)部位浸潤的NK細(xì)胞數(shù)目明顯高于galectin-9低表達(dá)組織(p0.0001)。斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)分析提示galectin-9表達(dá)與CD56+NK細(xì)胞浸潤顯著相關(guān)p0.0001；R2=0.658)。2.HT29細(xì)胞培養(yǎng)上清能顯著增強(qiáng)NK92的趨化運(yùn)動(dòng)。用siRNA-galectin-9轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞后,腫瘤上清對(duì)NK92細(xì)胞趨化作用受到抑制,該抑制作用在siRNA#378和siRNA #690組達(dá)到顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.重組galectin-9能顯著增強(qiáng)NK92的趨化運(yùn)動(dòng)。4.趨化實(shí)驗(yàn)證實(shí)Y27632和C3轉(zhuǎn)移酶能顯著抑制NK細(xì)胞的遷移。重組galectin-9能顯著增加NK92細(xì)胞中Rho家族多種分子的mRNA表達(dá),包括RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, RhoQ和RhoTl。此外,用重組Galectin-9刺激NK92細(xì)胞24小時(shí)后,ROCK1蛋白表達(dá)水平上調(diào)。5.重組galectin-9影響NK92細(xì)胞中F-actin細(xì)胞骨架的重排。6. Galectin-9能通過影響Rho/ROCK1通路相關(guān)分子表達(dá)增強(qiáng)原代NK細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)。結(jié)論：在結(jié)腸癌中,NK細(xì)胞的浸潤與該部位galectin-9表達(dá)呈正相關(guān),該分子可以通過活化Rho/ROCK1信號(hào)通路調(diào)節(jié)NK細(xì)胞中F-actin極化進(jìn)而影響NK細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究galectin-9調(diào)控NK細(xì)胞募集提供了較好的研究基礎(chǔ),并提示該分子可能成為結(jié)腸癌免疫治療的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。第三部分Tim。3在結(jié)直腸癌患者外周免疫細(xì)胞上的表達(dá)及臨床.意義研究目的：檢測CRC患者及健康志愿者外周血中不同淋巴細(xì)胞亞群上Tim-3表達(dá),并分析Tim-3表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。方法：1.入組人群：本研究納入了自2013年5月至2013年10月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院接受治療的CRC患者89例,以及年齡與性別匹配的健康志愿者38例。2.流式細(xì)胞學(xué)檢測：多色流式細(xì)胞儀分析患者及健康志愿者外周血中T細(xì)胞,NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞分布及Tim-3表達(dá)情況。結(jié)果：1.與健康對(duì)照相比,未手術(shù)CRC患者外周血NK細(xì)胞百分比顯著降低p=0.0027),但是T細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例無顯著差異(p0.05)。2.Tim-3在NK細(xì)胞上的表達(dá)水平明顯高于NKT細(xì)胞和T細(xì)胞。CRC患者外周血中Tim-3+NK細(xì)胞水平明顯低于健康對(duì)照(p=0.0239)。3.外周NK細(xì)胞和Tim-3+NK細(xì)胞的水平與CRC患者的臨床腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)。與Ⅳ期患者相比,Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期患者有較高水平的循環(huán)NK細(xì)胞水平(p=0.0014)。此外,未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者之間Tim-3+NK細(xì)胞水平也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.0218)。4.手術(shù)切除患者與未接受手術(shù)治療CRC患者之間循環(huán)淋巴細(xì)胞百分比無顯著差異。但是,手術(shù)切除患者外周血中Tim-3+NK細(xì)胞水平明顯高于未手術(shù)患者(p=0.0003)。手術(shù)能顯著提高患者術(shù)前外周NK細(xì)胞上較低的Tim-3表達(dá)水平(p=0.0126)。5.我們未發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞水平及Tim-3表達(dá)模式的改變與患者術(shù)前腫瘤標(biāo)志物水平之間存在相關(guān)性。結(jié)論：CRC患者術(shù)前NK細(xì)胞上較低的Tim-3表達(dá)水平與疾病的進(jìn)展及較差的預(yù)后臨床參數(shù)相關(guān),提示Tim-3是結(jié)直腸癌患者NK細(xì)胞上的一種生物活性標(biāo)記物。至于galectin-9是否通過Tim-3影響NK細(xì)胞仍需要后期實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。小結(jié)：1.結(jié)腸癌腫瘤中低表達(dá)的galectin-9可預(yù)測患者的不良預(yù)后；并可以通過Rho/ROCK1通路調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的浸潤；2.CRC患者外周血中NK細(xì)胞水平及Tim-3表達(dá)顯著降低,并且與患者較差的TNM分期相關(guān)。創(chuàng)新點(diǎn)：1.從免疫學(xué)角度,探討了CRC腫瘤細(xì)胞來源galectin-9的臨床意義及對(duì)NK細(xì)胞浸潤的影響,結(jié)果提示galectin-9調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)galectin-9調(diào)節(jié)NK細(xì)胞中Rho/ROCK1通路及F-actin的極化,而對(duì)于其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。2.初步探討CRC外周血中不同淋巴細(xì)胞亞型上Tim-3的表達(dá)水平及臨床意義,發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞上Tim-3表達(dá)降低且提示患者較晚的臨床分期,這可能是galectin-9調(diào)節(jié)NK細(xì)胞及CRC患者腫瘤免疫逃逸的另一潛在機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34
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本文編號(hào)：2137426