發(fā)布時(shí)間：2018-07-18 08:51

【摘要】：研究目的目前,胃癌(Gastric cancer GC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一,其致死率位于腫瘤的前列,這與腫瘤轉(zhuǎn)移及臨床抗血管治療的療效差有關(guān)。腫瘤血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry VM)是一種特殊的腫瘤血液供應(yīng)模式,它和內(nèi)皮依賴性血管不同,其管壁是由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成。VM影響腫瘤的進(jìn)展及不良預(yù)后,其形成和EMT及腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。HMGA2(High mobility group protein A2)在癌癥的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用,它不僅可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生還可以影響腫瘤干細(xì)胞的特性。然而,到目前為止,在胃癌中,HMGA2和VM的關(guān)系仍然不清楚,因此本研究擬探討HMGA2在胃癌VM形成的作用及分子機(jī)制。利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)初步分析了228例胃癌組織中HMGA2和VM的關(guān)系,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及裸鼠移植瘤模型驗(yàn)證了HMGA2可以促進(jìn)腫瘤的VM形成、EMT發(fā)生,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的干性,同時(shí)利用Ch IP/Co-IP等技術(shù)闡明了HMGA2影響VM形成的具體分子機(jī)制,為臨床胃癌的抗血管治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。研究方法1.收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院和附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本228例,經(jīng)病理醫(yī)師再次確診后隨訪,應(yīng)用免疫組化和CD34/PAS雙重染色方法檢測胃癌組織中HMGA2的表達(dá)水平和VM存在情況。分析HMGA2的表達(dá)與胃癌臨床病理因素、VM之間的相關(guān)性及其與患者生存預(yù)后的關(guān)系。2.應(yīng)用免疫組化檢測人體胃癌組織中EMT相關(guān)指標(biāo)(E-cadherin、Vimentin、Twist1、β-catenin)、VM相關(guān)指標(biāo)(VE-cadherin、VEGF、MMP2)及干性指標(biāo)(CD44)表達(dá),并進(jìn)一步分析這些指標(biāo)和HMGA2的相關(guān)性。3.應(yīng)用Western blot篩選出本底低表達(dá)和高表達(dá)HMGA2的胃癌細(xì)胞系,構(gòu)建HMGA2過表達(dá)質(zhì)粒和sh RNA質(zhì)粒,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法分別上下調(diào)HMGA2,并篩選出相應(yīng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。隨后用Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效果,RT-PCR及Western blot分別檢測EMT相關(guān)指標(biāo)(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Twist1)、VM相關(guān)指標(biāo)(VE-cadherin、VEGF、MMP2、MMP9)及干性相關(guān)指標(biāo)(CD44、ALDH1、Sox2、OCT4、c-Myc)的表達(dá)變化,免疫熒光檢測EMT、VM及干性相關(guān)指標(biāo)(E-cadherin、Vimentin、Twist1、VE-cadherin、CD44、ALDH1)的表達(dá)。4.運(yùn)用劃痕、侵襲、遷移實(shí)驗(yàn),MTT增殖、平板克隆形成、無血清懸浮成球?qū)嶒?yàn)及Matrigel三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測HMGA2對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移,增殖,管道形成能力的影響。5.通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測HMGA2與Twist1的關(guān)系,并通過Co-IP、Ch IP驗(yàn)證HMGA2和Twist1的互作關(guān)系。在HMGA2低表達(dá)的胃癌細(xì)胞系中,通過上調(diào)HMGA2及上調(diào)HMGA2并同時(shí)下調(diào)Twist1,應(yīng)用Western blot及細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)(遷移實(shí)驗(yàn)及體外三維培養(yǎng))進(jìn)而驗(yàn)證HMGA2與Twist1的相互作用。6.通過將穩(wěn)定過、降表達(dá)HMGA2的胃癌細(xì)胞系接種到裸鼠皮下,構(gòu)建裸鼠胃癌移植瘤模型,再次驗(yàn)證HMGA2對(duì)胃癌的作用。通過測量并繪制腫瘤生長曲線,檢測HMGA2對(duì)腫瘤體積及重量的影響;應(yīng)用IHC、Endomucin/PAS雙染技術(shù)檢測EMT、VM及CSC相關(guān)蛋白的表達(dá)情況及VM的形成情況,進(jìn)一步驗(yàn)證HMGA2對(duì)胃癌疾病進(jìn)展的影響。研究結(jié)果1.228例胃癌臨床病例樣本中,發(fā)現(xiàn)65例有VM結(jié)構(gòu),HMGA2呈陽性表達(dá)的有88例(38.6%);具有VM的患者中有42例標(biāo)本HMGA2陽性(64.6%),且HMGA2與VM-PAS計(jì)數(shù)具有相關(guān)性(r=0.4194,P0.001);HMGA2、VM均與腫瘤的組織分型、TNM分期、腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)相關(guān);Kaplan-Meier分析顯示,胃癌患者中HMGA2、VM與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。2.在胃癌組織中,Pearson檢驗(yàn)結(jié)果顯示HMGA2與Twist1、VE-cadherin、VEGF、E-cadherin、Vimentin、β-catenin、MMP2、CD44的表達(dá)存在相關(guān)性;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HMGA2的表達(dá)與VE-cadherin、Twist1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.3254,P0.001;r=0.208,P=0.016)。3.在胃癌細(xì)胞系(MKN45、MGC803、MKN28、MKN74)中,篩選出低表達(dá)HMGA2的細(xì)胞系MKN74、MKN28,高表達(dá)HMGA2的細(xì)胞系MKN45、MGC803。在胃癌細(xì)胞系MKN74和MKN28中轉(zhuǎn)染HMGA2的過表達(dá)質(zhì)粒后,無論是m RNA還是蛋白水平,Twist1和VE-cadherin均表現(xiàn)為表達(dá)增高,在蛋白水平E-cadherin表達(dá)降低,N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Snail、VEGF及干性相關(guān)指標(biāo)(CD44、ALDH1、Sox2、OCT4、c-Myc)表達(dá)增高。轉(zhuǎn)染了HMGA2下調(diào)質(zhì)粒的胃癌系胞系MKN45和MGC803在m RNA和蛋白水平,均表現(xiàn)為Twist1和VE-cadherin表達(dá)降低,在蛋白水平E-cadherin表達(dá)增高,N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Snail、VEGF及干性相關(guān)指標(biāo)(CD44、ALDH1、Sox2、OCT4、c-Myc)表達(dá)降低。4.胃癌細(xì)胞系MKN74和MKN28過表達(dá)HMGA2后,細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖及管道形成均增強(qiáng)(P0.05)。胃癌細(xì)胞系MKN45和MGC803下調(diào)HMGA2后,細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖及管道形成均降低(P0.05)。5.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果表明HMGA2可以增加Twist1、c-Myc的啟動(dòng)子的活性。Co-IP、Ch-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了HMGA2和Twist1存在互作關(guān)系。為了進(jìn)一步證明HMGA2是通過調(diào)控Twist1影響VM的形成,我們?cè)谏险{(diào)HMGA2的細(xì)胞系同時(shí)轉(zhuǎn)染Twist1的下調(diào)質(zhì)粒,結(jié)果表明細(xì)胞的遷移能力、管道形成能力明顯降低,同時(shí)N-cadherin、Vimentin、VE-cadherin的表達(dá)降低,但E-cadherin的表達(dá)水平?jīng)]有變化。6.同對(duì)照組比較,MKN74-HMGA2組移植瘤生長快、腫瘤體積大、重量增加,且腫瘤組織中EMT、VM相關(guān)蛋白(Vimentin、β-catenin、Twist1、VE-cadherin、VEGF、MMP2、)表達(dá)均升高,E-cadherin表達(dá)降低,CD44表達(dá)升高。同對(duì)照組相比較,MGC803-sh-HMGA2移植瘤生長慢、體積小、重量減少,且腫瘤組織中EMT及VM相關(guān)蛋白(Vimentin、β-catenin、Twist1、VE-cadherin、VEGF、MMP2)表達(dá)均降低,E-cadherin表達(dá)增高,CD44表達(dá)降低。研究結(jié)論1.胃癌組織中存在VM,且VM和胃癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān);HMGA2與VM關(guān)系密切,并影響病人生存預(yù)后;且HMGA2和VM形成相關(guān)蛋白關(guān)系密切,因此我們推測HMGA2可能影響VM的形成,進(jìn)而導(dǎo)致胃癌的不良預(yù)后。2.HMGA2與EMT及腫瘤細(xì)胞干性相關(guān),且促進(jìn)EMT的發(fā)生,并增加腫瘤細(xì)胞干性標(biāo)記物的表達(dá)。3.在體外,HMGA2促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖、克隆形成和管道形成;在體內(nèi),HMGA2促進(jìn)腫瘤的生長及VM形成。4.Twist1是HMGA2的靶基因,Twist1的下調(diào)部分削弱HMGA2介導(dǎo)的對(duì)VM的促進(jìn)作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。5.HMGA2通過直接結(jié)合Twist1的啟動(dòng)子區(qū)域增強(qiáng)Twist1的轉(zhuǎn)錄,并上調(diào)VE-cadherin的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)VM的形成。
[Abstract]:In this study , the relationship between tumor angiogenesis and tumor metastasis and prognosis of gastric cancer was studied by immunohistochemistry and CD34 / PAS staining . In this paper , the effects of HMG - A2 on the invasion , migration , proliferation and formation of gastric cancer cells were investigated by means of double - luciferase reporter gene assay . In gastric cancer cell lines MKN74 , MKN28 , E - cadherin , vimentin , 尾 - catenin , MMP2 and CD44 were correlated with the expression of MMP - cadherin , VEGF , E - cadherin , vimentin , 尾 - catenin , MMP2 and CD44 in gastric cancer cell lines MKN74 and MKN28 . c-Myc)琛ㄨ揪澧為珮.杞煋浜咹MGA2涓嬭皟璐ㄧ矑鐨勮儍鐧岀郴鑳?yōu)绯籑KN45鍜孧GC803鍦╩ RNA鍜岃泲鐧芥按騫，

本文編號(hào)：2131389