本文選題：骨肉瘤阿霉素耐藥 + microRNA-184��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：[背景]骨肉瘤是一種在青少年中多發(fā)并且能夠嚴(yán)重危害到人類生命健康的惡性骨腫瘤。通常單純手術(shù)治愈率大約在15%～20%左右,并且會(huì)導(dǎo)致患者肺轉(zhuǎn)移、截肢甚至死亡。經(jīng)過藥物治療骨肉瘤病人的5年生存率能夠提高到70%左右,研究人員在臨床治療中得出骨肉瘤能夠?qū)σ恍┛鼓[瘤藥物產(chǎn)生耐藥性包括鉑類、多柔比星、MTX以及阿霉素等等[1]。骨肉瘤產(chǎn)生的耐藥性對選擇治療方案以及病人的預(yù)后都會(huì)產(chǎn)生不利的因素,并能夠嚴(yán)重影響骨肉瘤病人的生存率。只有研究骨肉瘤耐藥的分子機(jī)制,才能逆轉(zhuǎn)化療耐藥問題,減少骨肉瘤復(fù)發(fā),提高患者生存率�；熌退庍^程由多因素、多水平、多基因參與調(diào)控的。產(chǎn)生耐藥性的具體機(jī)制暫時(shí)沒有明確的結(jié)論,為了研究骨肉瘤的耐藥機(jī)制,學(xué)者們采用抗癌藥物誘導(dǎo)的方法建立多藥耐藥細(xì)胞模型。曾恒[1]等采用阿霉素間斷大劑量沖擊誘導(dǎo)法快速建立了多藥耐藥MG-63細(xì)胞株,說明化療藥阿霉素本身就是耐藥的誘因,也就是說阿霉素引發(fā)的變化反過來會(huì)影響其發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用,這種耐藥機(jī)制是本研究的重點(diǎn)。很多機(jī)制都可能與骨肉瘤產(chǎn)生耐藥性有關(guān),其中包括細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白異常和細(xì)胞凋亡調(diào)控異常以及腫瘤干細(xì)胞的形成甚至是細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)作用等等,是多基因、多水平參與、多因素調(diào)控的過程。細(xì)胞凋亡異常是腫瘤惡性生物學(xué)行為的主要原因之一。調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡異常的過程可以由眾多凋亡蛋白以及相關(guān)基因參與,和骨肉瘤凋亡有關(guān)的基因包括BCL2家族、FAS/FASL家族、CASPASES(半胱天冬酶)以及P53家族等。骨肉瘤的常用抗腫瘤藥物發(fā)生耐藥機(jī)制目前還沒有明確的定論,目前認(rèn)為主要會(huì)涉及藥物的作用靶點(diǎn)突變、DNA修復(fù)、藥物的作用靶點(diǎn)突變以及藥物的攝取相關(guān)蛋白的改變等[2]。經(jīng)過研究可以得出與細(xì)胞的凋亡過程和原癌基因關(guān)系密切。盡管BC1-2是原癌基因,但是BC1-2并沒有增殖的作用也不能夠使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化,但是BC1-2可以在無生長因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子存在的條件下使細(xì)胞病毒感染的機(jī)會(huì)延長并且能夠讓細(xì)胞染色體畸變的概率增加,從而使細(xì)胞惡變形成腫瘤�，F(xiàn)階段BC 1-2基因被一些研究人員認(rèn)為有著抑制細(xì)胞凋亡的作用,BC1-2能夠使許多引起細(xì)胞凋亡的因素得到抑制從而抑制細(xì)胞凋亡。miRNA是非編碼RNA家族中的一員,也是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的主要小分子。經(jīng)過研究可以得出miRNA能夠在大多數(shù)腫瘤中起到抑癌基因的效果,特定的miRNA能夠參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的眾多階段[3]。一些成熟的miRNA可以和RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物結(jié)合后形成復(fù)合體。miRNA能夠直接對50%的蛋白編碼基因產(chǎn)生作用,同時(shí)也能夠參與大多數(shù)的生理過程,可以包含細(xì)胞生長和細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡和脂類代謝等等。miRNA也能夠?qū)υS多癌癥發(fā)揮出重要的作用,其中包括肺癌、白血病、結(jié)腸癌和骨肉瘤等。因?yàn)閙iRNA能夠調(diào)控多個(gè)蛋白質(zhì)的編碼基因,所以miRNA可以使有關(guān)的主要信號通路或者功能分子受到影響。由此可知miRNA相關(guān)信號通路和靶基因一起組成了一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其中niRNA能夠發(fā)揮出十分重要的生理功能[4]。只要表達(dá)失控,就能夠?qū)е履承┎±磉^程的進(jìn)展。經(jīng)過研究可以得出miRNA在骨腫瘤中能夠處于異常狀態(tài),有些miRNA被上調(diào)也有些miRNA則被下調(diào),這些miRNA能夠在腫瘤的發(fā)生與腫瘤的發(fā)展中起到抑癌基因或者癌基因的作用。有一些miRNA在骨肉瘤的發(fā)生與骨肉瘤發(fā)展中,能夠產(chǎn)生促進(jìn)作用。另外也有一些miRNA在骨肉瘤的發(fā)生與骨肉瘤發(fā)展中能夠產(chǎn)生抑制作用,經(jīng)過對骨肉瘤和miRNA關(guān)系的研究,能夠使miRNA在骨肉瘤中的作用機(jī)制得到證實(shí),并且可以為骨肉瘤的臨床治療中提出新的作用靶點(diǎn)。miR-184作為microRNA成員,現(xiàn)階段已經(jīng)得出它與腫瘤的發(fā)生以及腫瘤的發(fā)展有著密切的聯(lián)系�，F(xiàn)階段在肺癌、肝癌、鼻咽癌等多數(shù)的腫瘤中miR-184的表達(dá)異常,能夠作為癌基因調(diào)控分子或者通過調(diào)節(jié)BCL2與C-MYC信號通路,以及上調(diào)SND 1信號來促使腫瘤發(fā)生。因?yàn)樵诠侨饬鲋袑iR-184的研究目前并沒有公開作出證明,所以我們對它的分子機(jī)制研究目前尚不清楚。我們前期研究己經(jīng)證明了miR-184在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá),所以我們可以對miR-184能夠參與骨肉瘤耐藥的調(diào)節(jié)進(jìn)行預(yù)測。目前尚沒有關(guān)于miR-184參與骨肉瘤耐藥的報(bào)告,所以本研究擬探討miR-184對骨肉細(xì)胞耐藥發(fā)生發(fā)展的影響和機(jī)制,從而為臨床中的逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥的治療提供了新的作用靶點(diǎn)。本研究主要包括四個(gè)部分：第一章阿霉素影響microRNA-184在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)的驗(yàn)證；第二章microRNA-184影響阿霉素促凋亡作用的研究；第三章microRNA-184靶基因BCL2L1的驗(yàn)證；第四章MicroRNA-184影響阿霉素對BCL2L1抑制作用的研究。[目的]1、研究阿霉素對microRNA-184表達(dá)的影響和對骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用。2、研究microRNA-184對阿霉素促凋亡作用的影響和分子機(jī)制。[方法]1、細(xì)胞培養(yǎng)人骨肉瘤U-2 OS/MG-63細(xì)胞系,購買自中國科學(xué)院生化與細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫；含10%的熱滅活胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100ug/ml的高糖DMEM培養(yǎng)基被用于培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞。2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定microRNA-184合成microRNA-184 (miR-184)和內(nèi)參U6的real-time PCR引物。為了測定miR-184的表達(dá),骨肉瘤U-2 OS/MG-63細(xì)胞系分別暴露于0.5 nM或1.0 nM阿霉素達(dá)Oh、6h、12h、24h、48h后收集細(xì)胞。骨肉瘤細(xì)胞總RNA被提取、逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)并以U6 snRNA作為內(nèi)參。miRNA基因干擾實(shí)驗(yàn)分為control組、NC組、Agomir組、Antagomir組共四組。轉(zhuǎn)染前確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)良好。參考lipo2000轉(zhuǎn)染劑使用說明和銳博miRNA基因干擾試劑的使用說明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,48h后四組細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基,其中NC組、Agomir組、Antagomir組培養(yǎng)基為含濃度0.5nM阿霉素的上述培養(yǎng)基。4、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功24h后在流式管中輕柔加入緩沖液使得細(xì)胞充分懸�。涣魇焦芟群蠹尤階nnexin V-FIFC、7AAD混勻反應(yīng)后開始流式細(xì)胞儀的分析并計(jì)算凋亡率。5、驗(yàn)證miR-184靶點(diǎn)實(shí)驗(yàn)含miR-184結(jié)合位點(diǎn)的野生型BCL2L1 3'UTR和突變型BCL2L1 3'UTR的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒由Promega公司合成并鑒定,它們被分別與miR-184激動(dòng)劑共轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后檢測熒光素酶活性并計(jì)算螢火蟲熒光/海腎的熒光的比值,證實(shí)miR-184對BCL2L1表達(dá)的影響。6.阿霉素影響B(tài)CL2L1蛋白表達(dá)分析。通過Western-blot技術(shù)檢測骨肉瘤細(xì)胞BCL2L1蛋白表達(dá)情況。取人骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS經(jīng)過復(fù)蘇培養(yǎng),第一次傳代后,更換培養(yǎng)液為含濃度0.5nM或1.0nM阿霉素上述培養(yǎng)基。分別于0h,6h,12h,24h,48h提取細(xì)胞的總蛋白后進(jìn)行進(jìn)行SDS-PAGE電泳,通過Western blot檢測驗(yàn)證BCL2L1蛋白差異性表達(dá),并以GAPDH為內(nèi)參。7、microRNA-184和阿霉素共同影響B(tài)CL2L1表達(dá)的分析骨肉瘤細(xì)胞以1x105/孔密度接種于裝有載玻片的12孔平板上,當(dāng)骨肉瘤細(xì)胞生長至2x105/孔時(shí)分別應(yīng)用microRNA-184激動(dòng)劑和拮抗劑進(jìn)行基因干擾,48小時(shí)后細(xì)胞暴露于含0.5nm阿霉素的培養(yǎng)基中,24小時(shí)后提取細(xì)胞的總蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,通過Western blot檢測驗(yàn)證BCL2L1蛋白差異性表達(dá),并以GAPDH為內(nèi)參。8.統(tǒng)計(jì)分析：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0進(jìn)行分析,取4次其獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。對于不同時(shí)間點(diǎn)的測定,使用兩個(gè)重復(fù)測量因素的方差分析。其余結(jié)果分析采用單因素方法分析,滿足方差齊性時(shí)應(yīng)用LSD法進(jìn)行多重比較,當(dāng)方差不齊時(shí)應(yīng)用Dunnett's C法進(jìn)行多重比較,取4次其獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為：α0.05,選用95%作為可信區(qū)間,p0.05可以認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)果]1.阿霉素對體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞表達(dá)水平的影響研究結(jié)果顯示,在0.5nm濃度的阿霉素作用下,體外培養(yǎng)的兩種骨肉瘤細(xì)胞系,U-2 OS和MG-63均自6小時(shí)上調(diào)miR-184表達(dá)(P0.05),到表達(dá)高峰后均顯著下調(diào)(P0.05)。與低濃度相比,1.0nm濃度的阿霉素作用下的miR-184上調(diào)幅度更高(P0.05),且下降幅度低于低濃度的影響(P0.05)。2.miR-184異常表達(dá)影響細(xì)胞的凋亡結(jié)果顯示,阿霉素引發(fā)骨肉瘤細(xì)胞凋亡率增加。與陰性對照組相比,上調(diào)miR-184可降低凋亡率(P0.05),即削弱由阿霉素所引發(fā)的U-2 OS細(xì)胞凋亡。而下調(diào)miR-184可提高凋亡率(P0.05),即有利于阿霉素發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用。此表現(xiàn)同樣見于MG-63細(xì)胞。3. BCL2L1是miR-184的靶基因通過PCR的擴(kuò)增產(chǎn)生的突變型以及野生型載體經(jīng)過測序證實(shí)和之前預(yù)測的序列相同。雙酶切后連接在雙熒光素酶載體上,并且成功的構(gòu)造出突變型的雙熒光素酶表達(dá)載體以及野生型的雙熒光素酶表達(dá)載體。對照組以及實(shí)驗(yàn)組的載體在和miR-184激動(dòng)劑共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,經(jīng)過檢驗(yàn)得出跟突變型載體相比,野生型載體熒光素酶的活性顯著增加。4.阿霉素抑制BCL2L1表達(dá)以濃度0.5nm的阿霉素處理人骨肉瘤U-2 OS細(xì)胞系,分別在Oh,6h、12h、24h、48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn),采用Western-blot檢測BCL2L1的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間推移,BCL2L1的表達(dá)逐漸減低(P0.05)。阿霉素抑制BCL2L1的表達(dá),并隨時(shí)間推移而作用增強(qiáng)。5. microRNA-184削弱阿霉素對BCL2L1的抑制作用為探明miR-184的干擾作用,采用Western-blot測定BCL2L1的表達(dá),結(jié)果顯示,與未處理組(control組)相比,陰性對照組(NC組)BCL2L1的表達(dá)受到阿霉素明顯抑制。miR-184激動(dòng)劑轉(zhuǎn)染組(Ago組)的BCL2L1表達(dá)量高于NC組(P0.05),但尚低于control組(P0.05),即上調(diào)miR-184將削弱阿霉素對BCL2L1表達(dá)的抑制作用。而miR-184拮抗劑轉(zhuǎn)染組(Antago組)比NC組BCL2L1的表達(dá)顯著降低(P0.05),即下調(diào)miR-184將加劇阿霉素對BCL2L1表達(dá)的抑制作用。凋亡率與BCL2L1蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)一種顯著的正相關(guān)關(guān)系,其相關(guān)性系數(shù)達(dá)到80%(R=0.8069,P0.01)。[結(jié)論]1、阿霉素上調(diào)miR-184在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá),提示miR-184可能參與阿霉素誘導(dǎo)耐藥過程。2、上調(diào)骨肉瘤中miR-184的表達(dá)可削弱阿霉素的促凋亡作用,上調(diào)miR-184的表達(dá)則加劇阿霉素的促凋亡作用。3、BCL2L1存在miR-184的結(jié)合位點(diǎn),miR-184通過上調(diào)BCL2L1參與阿霉素誘導(dǎo)耐藥的過程。4、阿霉素抑制BCL2L1蛋白表達(dá),其作用強(qiáng)于miR-184的上調(diào)作用�？沟蛲龅鞍譈CL2L1表達(dá)量與骨肉瘤凋亡率相關(guān)。5、miR-184通過上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中抗凋亡蛋白BCL2L1的表達(dá),削弱阿霉素對BCL2L1的抑制,使骨肉瘤抗凋亡能力增強(qiáng),減弱阿霉素對骨肉瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng),產(chǎn)生耐藥；另一方面,miR-184通過下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中BCL2L1蛋白的表達(dá),增強(qiáng)了阿霉素對BCL2L1的抑制,骨肉瘤抗凋亡能力減弱,提高阿霉素對骨肉瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng),逆轉(zhuǎn)化療耐藥。
[Abstract]:BACKGROUND OF THE INVENTION Osteosarcoma is a malignant bone tumor which is multiple in adolescents and can seriously harm human life and health . Generally , the cure rate is about 15 % ~ 20 % , and the patient ' s lung metastasis , amputation and even death can be caused . The 5 - year survival rate of patients with osteosarcoma can be improved to about 70 % . The results show that osteosarcoma can be resistant to some anti - tumor drugs including platinum , doxorubicin , MTX , and adriamycin . In order to study the drug - resistant mechanism of osteosarcoma , many mechanisms may be involved in the drug resistance of osteosarcoma , including BCL2 family , FAS / FASL family , CASPASES ( caspase ) and P53 family . Although BC1 - 2 is a proto - oncogene , BC1 - 2 does not have the effect of inhibiting apoptosis , but BC1 - 2 can inhibit the apoptosis of cells . BC1 - 2 can inhibit the apoptosis of cells . BC1 - 2 is a member of non - coding RNA family and is the main small molecule for regulating gene expression after transcription . miRNA can play an important role in many cancers , including lung cancer , leukemia , colon cancer , osteosarcoma , etc . miRNA can exert important roles on many cancers , including lung cancer , leukemia , colon cancer and osteosarcoma . The research on the relationship between miR - 184 and osteosarcoma has shown that miR - 184 can play a role in the development of osteosarcoma , and can be used as a cancer gene regulatory molecule or by regulating BCL2 and C - MYC signaling pathway and up - up SND 1 signal .
The second chapter studies the effect of microRNA - 184 on adriamycin - induced apoptosis .
Chapter III Validation of the microRNA - 184 target gene BCL2L1 ;
AIM : To study the effects of adriamycin on the expression of microRNA - 184 and the anti - tumor effect on osteosarcoma cells .
The expression of miR - 184 was determined by real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) .
The expression of BCL2L1 protein was determined by Western blot . The results showed that in vitro cultured human osteosarcoma cell lines , U - 2 OS and MG - 63 increased the expression of miR - 184 ( P0.05 ) . Compared with the negative control group , the expression of miR - 184 increased significantly ( P0.05 ) . The expression of BCL2L1 in osteosarcoma cells was significantly lower than that of NC group ( P0.05 ) .
On the other hand , the expression of BCL2L1 protein in osteosarcoma cells is regulated by miR - 184 , the inhibition of adriamycin on BCL2L1 is enhanced , the anti - apoptosis capacity of osteosarcoma is weakened , and the anti - tumor effect of adriamycin on osteosarcoma cells is improved , and the resistance of chemotherapy is reversed .
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1

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6 林博川;MicroRNA-184在骨肉瘤阿霉素耐藥中的功能與機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

7 包擁政;miR-664調(diào)控靶基因SOX7促進(jìn)MG-63骨肉瘤細(xì)胞體外侵襲和遷移機(jī)理研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

8 陳斌;miR-664下調(diào)靶基因FOXO4促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

9 閆廣寧;骨肉瘤干細(xì)胞自我更新的調(diào)控機(jī)制及意義[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

10 程思;S100A9在骨肉瘤中的表達(dá)和對骨肉瘤功能作用的影響及相關(guān)機(jī)制的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 關(guān)國鋒;CXCR4靶點(diǎn)近紅外光學(xué)分子成像檢測骨肉瘤原位及肺轉(zhuǎn)移腫瘤病灶的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 王志濤;CD44s、CD44v6及CD44v9在骨肉瘤、骨巨細(xì)胞瘤及骨軟骨瘤標(biāo)本的表達(dá)及臨床意義[D];吉林大學(xué);2016年

3 榮小麗;LIMK1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染骨肉瘤耐藥細(xì)胞系的建立及其增殖侵襲能力的研究[D];吉林大學(xué);2016年

4 關(guān)紅亞;miR-192靶向TCF7基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖和侵襲的抑制作用[D];鄭州大學(xué);2016年

5 閆紅衛(wèi);骨肉瘤臨床診治的影像學(xué)檢查優(yōu)化探討[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2016年

6 劉京偉;小兒長管骨骨毮炎與骨肉瘤影像學(xué)對比研究[D];山東大學(xué);2016年

7 王坤;GRM4基因多態(tài)性與骨肉瘤的遺傳易感性及臨床病理特征的相關(guān)性研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2016年

8 王汀;骨肉瘤治療研究進(jìn)展[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

9 杜飛舟;骨肉瘤~（31）P磁共振波譜研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

10 張波;43例骨肉瘤患者預(yù)后的多因素分析[D];浙江大學(xué);2010年

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本文編號：2106983