本文選題：FOXP3 + COX2�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景結(jié)腸癌是發(fā)病率較高的癌癥之一,經(jīng)傳統(tǒng)治療后經(jīng)常發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,雖然其具體的機(jī)制至今仍未完全闡明,但是腫瘤內(nèi)少數(shù)具有自我更新、無(wú)限分化以及化療抵抗的腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells,CSCs)的存在被認(rèn)為在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著主要的作用。近年來(lái),用CSCs理論來(lái)解釋腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移受到了科學(xué)家們的廣泛認(rèn)可,因此,清除CSCs在腫瘤的治療過(guò)程中十分重要。環(huán)氧合酶-2(COX2)是環(huán)氧合酶(COX)同工酶中的一種,它是花生四烯酸向前列腺素(包含前列腺素E2,PGE2)代謝轉(zhuǎn)化所必需的酶。研究發(fā)現(xiàn),COX2和PGE2在促進(jìn)干細(xì)胞自我更新過(guò)程中發(fā)揮了很重要的作用。近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn):COX2在結(jié)腸癌以及其它種類(lèi)CSCs中表達(dá)上調(diào);COX2特異性抑制劑可以降低結(jié)腸癌干細(xì)胞樣球體(Colonosphere)的形成效率(Sphere formation efficiency)。但是COX2在結(jié)腸癌干細(xì)胞(Colon Cancer Stem Cells,CCSCs)中異常表達(dá)的機(jī)制還不是很明了。因此,尋找能夠抑制COX2的分子在CCSCs的研究中十分重要。FOXP3(Forkhead box protein 3)是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory cells,Tregs)標(biāo)志性分子,通過(guò)調(diào)節(jié)Tregs細(xì)胞功能發(fā)揮免疫抑制作用。近年來(lái)的研究表明,FOXP3也高表達(dá)于結(jié)腸癌以及其它腫瘤細(xì)胞中。在乳腺癌、卵巢癌以及其它癌癥中發(fā)揮抑癌作用。我們課題組在胃癌的研究中證明,FOXP3可以通過(guò)與NF-κB的相互作用抑制其活性,進(jìn)而抑制COX2的表達(dá)水平,從而發(fā)揮對(duì)腫瘤的抑制功能。這提示FOXP3是一個(gè)具有抑癌作用的基因,能夠通過(guò)與NF-κB相互作用抑制腫瘤。但是FOXP3在CSCs形成和自我更新中的作用尚不清楚。目的本研究主要深入研討FOXP3對(duì)CCSCs自我更新的影響及其具體的分子機(jī)制。方法1.通過(guò)幾種不同的人結(jié)腸癌細(xì)胞系在特定培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)Colonosphere;通過(guò)Real-Time PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)分析結(jié)腸癌細(xì)胞和Colonosphere中FOXP3和COX2的表達(dá)差異以及其相關(guān)性。2.通過(guò)感染腺病毒的方法過(guò)表達(dá)/干涉結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中FOXP3的表達(dá)量,然后培養(yǎng)Colonosphere;通過(guò)顯微鏡觀(guān)察分析過(guò)表達(dá)/干涉FOXP3對(duì)Colonosphere形成效率的影響;通過(guò)側(cè)群細(xì)胞(Side population cells,SP)實(shí)驗(yàn)分析過(guò)表達(dá)/干涉FOXP3對(duì)SP細(xì)胞比例的影響;通過(guò)Real-Time PCR分析過(guò)表達(dá)/干涉FOXP3對(duì)CCSCs表面標(biāo)志物的影響;通過(guò)小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)分析過(guò)表達(dá)/干涉FOXP3對(duì)CCSCs在小鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。3.通過(guò)免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)分析FOXP3和NFκB亞基p65蛋白相互作用;通過(guò)Real-Time PCR和Western Blot分析過(guò)表達(dá)/干涉FOXP3對(duì)COX2基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響以及同時(shí)干涉FOXP3和p65對(duì)COX2基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響;通過(guò)Luciferase報(bào)告基因分析過(guò)表達(dá)FOXP3對(duì)COX2啟動(dòng)子活性的影響以及過(guò)表達(dá)FOXP3的同時(shí)利用TNFα誘導(dǎo)p65入核對(duì)COX2啟動(dòng)子的影響;染色質(zhì)免疫沉淀分析(CHIP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXP3是否與COX2啟動(dòng)子中的p65位點(diǎn)結(jié)合。4.通過(guò)感染腺病毒的方法培養(yǎng)干涉FOXP3、干涉COX2以及同時(shí)干涉FOXP3和COX2的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29,然后培養(yǎng)Colonosphere;通過(guò)顯微鏡觀(guān)察分析干涉COX2對(duì)由低表達(dá)FOXP3引起的Colonosphere形成效率增強(qiáng)的影響;通過(guò)SP實(shí)驗(yàn)分析干涉COX2對(duì)由低表達(dá)FOXP3引起的SP細(xì)胞比例增高的影響;通過(guò)Real-Time PCR分析干涉COX2對(duì)由低表達(dá)FOXP3引起的CCSCs表面標(biāo)志物表達(dá)水平升高的影響;通過(guò)小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)分析干涉COX2對(duì)由低表達(dá)FOXP3引起的CCSCs在小鼠體內(nèi)成瘤能力增強(qiáng)的影響。結(jié)果1.在幾種結(jié)腸癌細(xì)胞系中成功富集得到了經(jīng)典的神經(jīng)樣球體Colonosphere,通過(guò)Real-Time PCR以及流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),與結(jié)腸癌細(xì)胞相比,Colonosphere中CCSCs表面標(biāo)志物表達(dá)水平顯著升高,能夠?qū)⑵湟暈镃CSCs來(lái)開(kāi)展后面的實(shí)驗(yàn)。Real-Time PCR和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與對(duì)應(yīng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞相比,FOXP3在CCSCs中的表達(dá)水平有明顯的降低;而作為FOXP3下游靶基因的COX2,隨著FOXP3在CCSCs中表達(dá)量的降低,其表達(dá)量有顯著升高。在CCSCs中,兩者的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。2.通過(guò)在顯微鏡下觀(guān)察分析過(guò)表達(dá)/干涉FOXP3的HT29培養(yǎng)的Colonosphere,結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)FOXP3可以降低Colonosphere的形成效率;SP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)FOXP3可以降低SP細(xì)胞的比例;Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)FOXP3可以降低CCSCs多種表面標(biāo)志物的表達(dá)水平;小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)FOXP3可以降低CCSCs在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力。相反,干涉FOXP3可以增強(qiáng)Colonosphere的形成效率;增高SP細(xì)胞的比例;增高CCSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)水平;增強(qiáng)CCSCs在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力。3.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CCSCs中存在著FOXP3與p65蛋白相互作用;Real-Time PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)FOXP3可以降低CCSCs中COX2的m RNA和蛋白表達(dá)水平;相反,干涉FOXP3可以升高CCSCs中COX2的m RNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平;而在干涉FOXP3的同時(shí)干涉p65,由低表達(dá)FOXP3引起的COX2 m RNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)量升高的作用會(huì)受到拮抗;Luciferase報(bào)告基因結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)FOXP3可以降低COX2啟動(dòng)子的活性,而由TNFα誘導(dǎo)的p65入核可以拮抗由高表達(dá)FOXP3引起的COX2基因啟動(dòng)子活性受到抑制的作用;CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,FOXP3可以和COX2基因啟動(dòng)子上的p65位點(diǎn)相互結(jié)合。4.通過(guò)在顯微鏡下觀(guān)察分析干涉FOXP3以及同時(shí)干涉FOXP3和COX2的HT29培養(yǎng)的Colonosphere,結(jié)果表明,干涉FOXP3可以增強(qiáng)Colonosphere的形成效率;SP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,干涉FOXP3可以增加SP細(xì)胞的比例;Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,干涉FOXP3可以增強(qiáng)CCSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)水平;小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,干涉FOXP3可以增強(qiáng)CCSCs在小鼠體內(nèi)的形成腫瘤的能力。而在干涉FOXP3的同時(shí)干涉COX2,由低表達(dá)FOXP3引起的這些CCSCs自我更新能力增強(qiáng)的作用會(huì)受到抑制。結(jié)論在CCSCs中,FOXP3表達(dá)下調(diào),而COX2表達(dá)上調(diào),兩者的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。FOXP3可以顯著降低CCSCs的自我跟新能力。FOXP3可能通過(guò)與p65相互作用從而抑制NFκB介導(dǎo)的COX2轉(zhuǎn)錄激活。FOXP3通過(guò)COX2對(duì)CCSCs的自我更新起著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。因此,我們得出結(jié)論:FOXP3可能通過(guò)FOXP3/NFκB-COX2信號(hào)軸抑制CCSCs的自我更新。
[Abstract]:Background : The presence of COX - 2 ( COX2 ) plays an important role in tumor recurrence and metastasis . In recent years , it has been found that COX2 and PGE2 play an important role in promoting the self - renewal of stem cells . In the study of gastric cancer , the effect of overexpression / interference FoxP3 on the expression of COX2 gene and protein expression level in colon cancer cells and other tumor cells was analyzed . The effect of overexpression / interference FoxP3 on the expression of COX2 gene and protein was analyzed by means of Real - Time PCR and Western Blot . The results showed that overexpression of FoxP3 could decrease the expression level of COX2 in CCSCs . The results showed that overexpression of FoxP3 could decrease the expression of COX2 in CCSCs . There is a negative correlation between the expression levels of CCSCs , which can significantly reduce the self and the ability of CCSCs .
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.35
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本文編號(hào)：2104365