本文選題：干擾素α + 間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：在慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)治療領(lǐng)域干擾素-α (IFN-α)已應(yīng)用多年,但對其作用機(jī)制的研究一直沒有停止。最新研究進(jìn)展提示與伊馬替尼單用相比,IFN-α的聯(lián)合使用可顯著提高CML病人的分子生物學(xué)緩解率和長期無病生存率,出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能機(jī)制是IFN-α對靜止期白血病細(xì)胞的調(diào)控作用,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs),對白血病細(xì)胞的庇護(hù)作用,是調(diào)控白血病細(xì)胞周期停滯、逃避藥物殺傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此本研究從MSCs的角度出發(fā),探討IFN-α對MSCs生物學(xué)功能的影響和機(jī)制,以及IFN-α在調(diào)控MSCs庇護(hù)慢粒白血病細(xì)胞過程中的作用。具體研究分為三個(gè)部分：(1)IFN-α調(diào)控MSCs生物學(xué)功能的作用研究,(2)IFN-α靶基因PML對MSCs增殖與成骨分化的作用研究,(3)IFN-α/PML信號軸在調(diào)控MSCs庇護(hù)慢粒白血病細(xì)胞過程中的作用研究,并探尋可能的潛在機(jī)制。 第一部分IFN-α調(diào)控MSCs生物學(xué)功能的作用研究 目的：探討IFN-α對MSCs生物學(xué)功能的影響,并明確IFN-α靶基因PML在此過程中的作用 方法：在獲得倫理委員會批準(zhǔn)和志愿者知情同意后,我們?nèi)〗】抵驹刚吖撬?-3m1,密度梯度離心法分離MSCs。細(xì)胞接受不同濃度的IFN-α處理3、7或14天,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡。SA-β-gal染色方法分析細(xì)胞衰老情況。采用PCR和Western blot技術(shù)分析P53、P21、PML等的基因和蛋白表達(dá)水平。根據(jù)人PMLcDNA序列設(shè)計(jì)合成PML過表達(dá)質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒,由慢病毒轉(zhuǎn)染的方法改變MSCs中PML基因和蛋白的表達(dá)。免疫熒光技術(shù)對PML核定位進(jìn)行檢測。 結(jié)果：MSCs接受IFN-α處理3天時(shí),細(xì)胞增殖無明顯改變,IFN-α處理14天后,MSCs生長變慢,克隆形成能力顯著下降,然而并未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞衰老檢測顯示IFN-α可誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞衰老,并具有時(shí)間和濃度依賴性,同時(shí)伴隨著PML基因和蛋白的表達(dá)升高。隨后,對PML調(diào)控MSCs細(xì)胞衰老的作用進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示PML基因的表達(dá)升高可誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞衰老,轉(zhuǎn)染后第7天,PML過表達(dá)MSCs中,SA-β-gal染色陽性率顯著高于正常和轉(zhuǎn)染空載體的MSCs,(47.43±3.8%vs4.9±0.7%,5.97±±0.75%),熒光定量PCR檢測PML過表達(dá)的MSCs中,P21及P53基因表達(dá)水平增高。采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)MSCs中PML表達(dá)后，，IFN-α誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老作用被抑制,經(jīng)IFN-α (1000U/ml)處理7天后,與對照組相比,PML敲降后的MSCs中SA-β-gal陽性率降低(4.49±1.27%vs.17.26±1.44%),提示PML參與到IFN-α誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞衰老過程中。同時(shí),在IFN-α誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞衰老過程中發(fā)現(xiàn),PML與P53蛋白的共定位增加,而PML基因表達(dá)被敲降后,則未發(fā)現(xiàn)明顯的P53點(diǎn)狀定位,提示IFN-α介導(dǎo)的PML的表達(dá)增強(qiáng)可促進(jìn)P53蛋白定位于PML-NBs。。 結(jié)論：IFN-α可誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞衰老,而PML在IFN-α誘導(dǎo)衰老過程中起著非常關(guān)鍵的作用。 第二部分PML調(diào)控MSCs生物學(xué)功能的作用研究 目的：本部分?jǐn)M研究PML在MSCs增殖和成骨分化過程中的作用 方法：健康志愿者骨髓中分離培養(yǎng)MSCs, PCR、Western blot技術(shù)檢測不同狀態(tài)下MSCs中PML基因和蛋白的表達(dá),免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞增殖和成骨分化過程中,PML的定位及分布。慢病毒轉(zhuǎn)染方法改變MSCs中PML的表達(dá)。CCK-8檢測細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡。誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化,在誘導(dǎo)第7天或14天進(jìn)行Von kossa染色及ALP活性檢測。 結(jié)果：在MSCs細(xì)胞增殖過程中,PML基因和蛋白均可穩(wěn)定表達(dá),將MSCs誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化過程中,ALP表達(dá)升高,伴隨著PML基因的表達(dá)增強(qiáng),免疫熒光檢測顯示成骨分化過程中PML-NBs變大,與對照組相比,分化過程中PML-NBs分布不均勻。慢病毒轉(zhuǎn)染的方法增強(qiáng)MSCs中PML的表達(dá)后,細(xì)胞增殖被抑制,在過表達(dá)后第3天,與正常MSCs相比細(xì)胞增殖抑制率為20.57±4.18%,與轉(zhuǎn)染空載體的MSCs相比,增殖抑制率為18.46±3.53%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PML的過表達(dá)的MSCs中,未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞周期抑制,但當(dāng)使用RNA干擾的方法下調(diào)MSCs中PML表達(dá)后,細(xì)胞處于S+G2/M期的比例明顯增加。 將細(xì)胞誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化,誘導(dǎo)第7天,Von kossa染色結(jié)果顯示MSCs的鈣沉積顯著增多,與正常MSCs、轉(zhuǎn)染空載體的MSCs相比,PML過表達(dá)的MSCs鈣沉積增加最為明顯。ALP活性檢測趨勢一致,在正常MSCs、轉(zhuǎn)染空載體的MSCs與PML過表達(dá)的MSCs中,ALP活性分別為0.2±0.008，0.24±0.016以及0.39±0.019U/mg。隨后我們對未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測,結(jié)果顯示即使在沒有成骨誘導(dǎo)液作用下,PML過表達(dá)后的第7天,MSCs中染成棕黑色的細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積也明顯增多,同時(shí),與正常MSCs及轉(zhuǎn)染了空載體的MSCs相比,PML過表達(dá)的MSCs中ALP活性有一定程度的增高(0.049±0.006vs0.028±0.005,0.024±0.005U/mg,P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí),在未加成骨分化誘導(dǎo)液的情況下,PML過表達(dá)后的第7天,ALP的mRNA水平也有明顯增強(qiáng),當(dāng)PML表達(dá)被敲降,ALP mRNA的表達(dá)水平也下降。結(jié)論：PML可抑制MSCs增殖,但促進(jìn)其成骨分化。 第三部分IFN-∝/PML信號軸在調(diào)控MSCs庇護(hù)慢粒白血病細(xì)胞過程中的作用研究 目的：探討IFN-a及其靶基因PML對MSCs庇護(hù)作用的調(diào)控。并通過全基因組表達(dá)譜分析,尋找潛在的可能機(jī)制。 方法：CML細(xì)胞株K562單獨(dú)或與MSCs共培養(yǎng),在共培養(yǎng)4小時(shí)時(shí)加入1μM伊馬替尼,藥物作用72小時(shí)后,流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。全基因組表達(dá)譜分析正常MSCs,轉(zhuǎn)染空載體MSCs及PML過表達(dá)的MSCs中的基因表達(dá)差異,尋找有意義的基因。 結(jié)果：K562細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)后增殖速度明顯減慢,但細(xì)胞凋亡比例并未增加。當(dāng)MSCs接受IFN-α (1000U/ml)或IM(1μM)預(yù)處理3天后,再與K562細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),發(fā)現(xiàn)與IM處理組相比,IFN-α處理組共培養(yǎng)的K562細(xì)胞擴(kuò)增速度較快,K562細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于IM組。隨后,K562細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組及與MSCs共培養(yǎng)組接受1州的伊馬替尼處理,凋亡檢測結(jié)果顯示K562單獨(dú)培養(yǎng)組在IM處理72小時(shí)后,細(xì)胞凋亡率為62.32±8.44%,而有MSCs共培養(yǎng)時(shí),K562接受IM處理72小時(shí)后細(xì)胞凋亡率下降為33.15+7.78%,提示MSCs可保護(hù)K562逃避IM的殺傷。隨后我們使用IFN-α處理3天的MSCs細(xì)胞繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn),IFN-α處理后的MSCs對K562的保護(hù)作用下降,K562更易于被伊馬替尼殺傷,與IFN-α處理過的MSCs共培養(yǎng)的K562細(xì)胞凋亡率為48.83±2.02%,高于對照組(33.15±±7.78%)。當(dāng)改變MSCs中PML的表達(dá)后發(fā)現(xiàn),MSCs中PML高表達(dá)組,共培養(yǎng)的K562細(xì)胞凋亡率為49.1±±5.03%,顯著高于對照組(36.37+1.63%),而MSCs中PML表達(dá)下調(diào)后,K562凋亡率為35.15±±13.03%,低于對照組(41.18±±12.94%)。正反兩方面的結(jié)果提示,PML可能參與了MSCs對慢粒白血病細(xì)胞保護(hù)過程。全基因組表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),與正常MSCs和轉(zhuǎn)染空載體的MSCs相比,PML過表達(dá)后的MSCs中有357個(gè)基因有較明顯改變,除了PML基因外,3個(gè)上調(diào)最顯著的基因?yàn)镮L-1p,IL-8及IBSP,下調(diào)最為顯著的3個(gè)基因均為FGFR2。 結(jié)論：MSCs對慢粒細(xì)胞株K562有庇護(hù)作用,IFN-α處理后的MSCs對K562的庇護(hù)作用下降。改變MSCs中PML的表達(dá),也可能影響MSCs的庇護(hù)作用,表現(xiàn)為PML表達(dá)增強(qiáng)時(shí),MSCs對K562的庇護(hù)作用減弱,而PML表達(dá)下調(diào)時(shí),MSCs對K562的庇護(hù)作用增強(qiáng)。
[Abstract]:In this study , the effects of IFN - 偽 on the biological function of MSCs and the role of IFN - 偽 in the treatment of chronic leukemia cells were investigated .

Study on the Biological Function of the First Part of IFN - 偽 Regulation ;

Objective : To investigate the effect of IFN - 偽 on the biological function of MSCs .

Methods : After obtaining EC approval and informed consent of volunteers , we isolated MSCs from healthy volunteers bone marrow 2 - 3m1 and density gradient centrifugation . The cells were treated with different concentrations of IFN - 偽 for 3 , 7 or 14 days . Cell morphology and flow cytometry were used to detect cell cycle and apoptosis .

Results : When MSCs were treated with IFN - 偽 for 3 days , the proliferation of MSCs was not changed significantly . After 14 days of IFN - 偽 treatment , the growth of MSCs increased slowly , and the expression level of PML gene and protein was increased . The results showed that the positive rate of PML gene was decreased ( 4.49 鹵 1.27 % vs . 17.26 鹵 1.44 % ) .

Conclusion : IFN - 偽 can induce the senescence of MSCs , and PML plays a very important role in the course of IFN - 偽 induced senescence .

Study on the Biological Function of the Second Part of PML Regulatory MSCs ;

Objective : To study the role of PML in the proliferation and osteogenic differentiation of MSCs .

Methods : MSCs were isolated from bone marrow of healthy volunteers . The expression of PML gene and protein in MSCs were detected by PCR and Western blot . The expression of PML in MSCs was detected by immunofluorescence technique . The expression of PML in MSCs was detected by slow virus transfection . CCK - 8 detected cell proliferation and flow cytometry analysis of cell cycle and apoptosis . After inducing MSCs to differentiate into osteoblasts , Von kossa staining and ALP activity were detected on day 7 or 14 days .

Results : In the process of MSCs ' proliferation , PML gene and protein were stably expressed , and the expression of PML - NBs was increased during the differentiation of MSCs . The proliferation inhibition rate of PML - NBs was 20.57 鹵 4.18 % , compared with the control group . The proliferation inhibition rate was 18.46 鹵 3.53 % .

Compared with normal MSCs and MSCs transfected with empty vector , ALP activity increased significantly ( 0.049 鹵 0.006 vs 0.028 鹵 0.005 , 0 . 024 鹵 0.005U / mg , P0.05 ) .

Study on the Role of the Third Part of IFN - & lt ; & gt ; & lt ; & gt ; / PML Signal Axis in the Regulation and Control of the Slow - grained Leukemia Cells of MSCs

Objective : To investigate the role of IFN - a and its target gene PML in the asylum of MSCs .

Methods : CML cell line K562 was cultured in vitro or co - cultured with MSCs . After co - culture for 4 hours , 1 渭M imatinib was added . After 72 hours of drug action , flow cytometry was performed to detect apoptosis .

Results : After treated with IFN - 偽 ( 1000U / ml ) or IM ( 1 渭M ) for 3 days , the apoptosis rate of K562 cells was significantly higher than that in control group ( 33.15 鹵 8.44 % ) .

Conclusion : MSCs have a protective effect on K562 cells , and the effect of MSCs on K562 is decreased after IFN - 偽 treatment .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2099310