發(fā)布時間：2018-06-29 14:54

  本文選題：HPV18 + E5癌蛋白　； 參考：《北京工業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一類能引起皮膚和黏膜鱗狀上皮增殖的DNA腫瘤病毒。高危型HPV的感染與宮頸癌、食管癌、喉癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HPV主要編碼八種蛋白,其中E6、E7、E5為癌蛋白,它們可以通過與細(xì)胞中多種癌基因、抑癌基因及細(xì)胞受體相互作用,誘導(dǎo)細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)化。目前,對于HPV致癌機制的研究主要集中在E6、E7兩種癌蛋白上,而對于E5蛋白功能及致癌機制的研究卻很少,并且主要集中在HPV16型E5蛋白。已知HPV18屬于另一種常見的高危型HPV病毒,然而關(guān)于HPV18 E5蛋白在腫瘤形成過程中的作用及其機制仍不明了,因此有必要針對HPV18型E5蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及其調(diào)控機制開展相關(guān)研究。如果明確了HPV18 E5蛋白對細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化作用及其參與的細(xì)胞調(diào)控機制,就可以針對性地設(shè)計相應(yīng)的疫苗和靶向藥物。本文從系統(tǒng)進化的角度分析E5蛋白的系統(tǒng)發(fā)育與致癌性之間的關(guān)系。結(jié)果表明,同一“屬”的同一“種”乳頭瘤病毒E5蛋白在系統(tǒng)發(fā)育樹上屬于同一個分支,并且E5蛋白的系統(tǒng)發(fā)育與致癌性之間具有相關(guān)性,即高危型HPV的E5蛋白之間具有相近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,低危型HPV的E5蛋白之間具有相近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。通過對唐山地區(qū)食管癌樣本中HPV18 E5、E6、E7、L1基因的檢測分析發(fā)現(xiàn),有34/94(36%)的樣本中存在HPV18 E5基因序列,28/94(30%)的食管癌樣本中可以同時檢測到HPV18 E5、E6、L1基因的存在,25/94(27%)的樣本中可以同時檢測到HPV18 E5、E6、E7基因的存在。在HPV18 E5陽性的食管癌樣本中,有4例樣本發(fā)生了E5基因序列的突變,其中3例樣本的突變發(fā)生在起始密碼子位置。構(gòu)建pSecTag-HPV18E5真核表達(dá)重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染Balb/c 3T3細(xì)胞,利用質(zhì)粒上的博來霉素抗性基因,篩選獲得能穩(wěn)定表達(dá)HPV18 E5蛋白的陽性細(xì)胞株,通過CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù),分析HPV18 E5對細(xì)胞增殖及周期的影響。結(jié)果表明,HPV18 E5陽性細(xì)胞的增殖加快,S期和G2/M期在細(xì)胞周期中的比值增加,而G1期的比值下降。構(gòu)建并以能表達(dá)HPV18 E5蛋白的腺病毒為載體,運用本實驗室已建立的二階段細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗平臺,分析HPV18 E5蛋白誘導(dǎo)Balb/c 3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。應(yīng)用軟瓊脂克隆實驗檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞在軟瓊脂上形成克隆的能力。并通過細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遷移和侵襲能力。使用SCID小鼠致瘤實驗檢測HPV18 E5轉(zhuǎn)化細(xì)胞在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力。結(jié)果表明,與正常Balb/c 3T3細(xì)胞相比,感染了HPV18 E5腺病毒的Balb/c 3T3細(xì)胞,其細(xì)胞形態(tài)及功能發(fā)生了明顯的變化,表現(xiàn)在細(xì)胞呈致密多層生長、嗜堿深染、失去細(xì)胞間的接觸抑制及細(xì)胞的錨定生長作用。HPV18 E5轉(zhuǎn)化細(xì)胞形成20.00±0.58個轉(zhuǎn)化灶,將轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞接種在軟瓊脂上,克隆形成率為26.2±0.63%,而正常細(xì)胞卻不能在軟瓊脂上生長。轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有遷移和侵襲的能力,并能夠在SCID小鼠體內(nèi)形成成纖維瘤(1.5±0.3 cm)。結(jié)果說明,HPV18 E5蛋白具有誘導(dǎo)Balb/c 3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。通過real-time PCR實驗以及western blot實驗檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞中p21、p27、EGFR基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平上的變化。結(jié)果表明,HPV18 E5轉(zhuǎn)化細(xì)胞中p21、p27基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào),EGFR基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平均有升高。實驗結(jié)果說明,HPV18 E5蛋白可能是通過激活EGFR信號通路影響p21、p27等下游通路中抑癌基因的表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)化。綜上所述,本研究證實了HPV18 E5蛋白具有誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力,其機制可能是通過激活EGFR信號通路,影響細(xì)胞中p21、p27抑癌基因的表達(dá),使得細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。本研究對于闡明HPV18的致癌機理具有重要意義,并為HPV疫苗的研發(fā)提供了新的思路。
[Abstract]:HPV 18 E5 , E6 , E7 and E5 have been found to be involved in the development of HPV 18 E5 protein . The results showed that the proliferation of HPV18 E5 positive cells accelerated , the ratio of S phase and G2 / M phase in cell cycle increased , while the ratio of G1 phase decreased . The results showed that HPV18 E5 protein had the ability to induce the malignant transformation of Balb / c 3T3 cells . The expression level of p21 , p27 and EGFR in transformed cells was downregulated by real - time PCR and western blot . The results showed that HPV18 E5 protein could inhibit the expression of p21 and p27 in the downstream pathway such as p21 and p27 .
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2

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本文編號：2082474