發(fā)布時(shí)間：2018-06-28 11:34

  本文選題：PGAM1 + 腎透明細(xì)胞癌��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,重威脅著人們的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)在我國(guó)腎癌的發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì),且每10萬(wàn)人群中約有37位男性及16位女性患者被確診為腎癌。由于腎癌患者早期無(wú)明顯癥狀,25%-30%患者入院診斷時(shí)已為中晚期；同時(shí),腎癌患者對(duì)放療及化療并不敏感,因此,腎癌患者的主要治療方式為手術(shù)切除,然而20%以上的患者術(shù)后可能復(fù)發(fā)。因此,目前對(duì)于腎癌的治療仍不理想。透明細(xì)胞癌是腎癌最常見的組織學(xué)類型,約占70%-90%。然而,由于腎透明細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制尚不明確,對(duì)腎透明細(xì)胞癌治療新藥物的研發(fā)也帶來(lái)了極大的困難。因此,深入開展腎透明細(xì)胞發(fā)生及發(fā)展方面的基礎(chǔ)研究具有重要的意義。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展有關(guān)的越來(lái)越多蛋白被發(fā)現(xiàn),蛋白標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)不僅有助于腎癌患者的預(yù)后評(píng)估,同時(shí)也有助于臨床上對(duì)腎癌的診斷、術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)、也有望成為分子靶向藥物研發(fā)的的靶點(diǎn),應(yīng)用于臨床治療。因此,尋找與腎透明細(xì)胞癌相關(guān)的新基因,將有助于闡述腎透明細(xì)胞癌發(fā)生的機(jī)制,為其診斷及治療提供有價(jià)值的參考依據(jù)。PGAM1為PGAM家族成員,最初在腦組織內(nèi)發(fā)現(xiàn),才被命名為PGAM1;另一個(gè)成員與PGAM1為同型二聚體,主要存在于成熟骨骼肌和心肌組織中,命名為PGAM2[14-15]。PGAM1定位于人染色體10q25.3區(qū)域,全長(zhǎng)1709 bp,包括31bp的非翻譯區(qū)(5'UTR),765-bp的編碼區(qū),913bp的非翻譯區(qū)(3'UTR)。其cDNA編碼一個(gè)長(zhǎng)約254個(gè)氨基酸,分子量為28784 Da的蛋白質(zhì),其活性位點(diǎn)內(nèi)的三個(gè)氨基酸,分別為Hisll, Arg62和His186。而PGAM2的cDNA編碼253個(gè)氨基酸和一個(gè)較短的非翻譯區(qū)。PGAM1與PGAM2具有80%同源性,但二者含有不同酸性和堿性氨基酸殘基。PGAM2在人類基因組只有一個(gè)拷貝數(shù),而PGAM1基因有多個(gè)拷貝數(shù)。因此,PGAM1基因被認(rèn)為是PGAM2的祖基因。目前的研究認(rèn)為PGAM1參與調(diào)控糖代謝活動(dòng),主要將3-磷酸甘油酸催化生成2-磷酸甘油酸,最終降解為磷酸烯醇式丙酮酸；其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展也密切相關(guān),在結(jié)直腸癌、肝癌肺癌及乳腺癌組織中均發(fā)現(xiàn)了其表達(dá)高于周邊正常組織,然而在腦部腫瘤中卻發(fā)現(xiàn)其表達(dá)低于周邊正常組織。盡管如此,目前研究并沒(méi)有檢測(cè)PGAM1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)目的1、探討PGAM1在腎透明細(xì)胞癌及癌旁相對(duì)正常腎組織中的表達(dá)及其臨床意義。2、探討PGAM1在在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。3、探討PGAM1表達(dá)下調(diào)對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其作用機(jī)制。方法1、收集192例腎透明細(xì)胞癌組織及80例腎癌遠(yuǎn)端正常腎組織中,經(jīng)固定、脫水制成石蠟組織塊,采用免疫組化檢測(cè)PGAM1的表達(dá),并分析PGAM1在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。2、采用qRT-PCR定量檢測(cè)了3對(duì)腎透明細(xì)胞癌及配對(duì)遠(yuǎn)端正�！I組織中PGAM1mRNA的表達(dá),同時(shí),通過(guò)Western blot定量檢測(cè)了8對(duì)腎透明細(xì)胞癌及配對(duì)正常腎組織中PGAM1蛋白的表達(dá)情況,進(jìn)一步明確PGAM1在’腎癌及癌旁腎組織中的表達(dá)。3、采用qRT-PCR檢測(cè)了PGAM1在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株RLC-310及Caki-2中的表達(dá)。同時(shí),行siRNA干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,敲低PGAM1在’腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株RLC-310及Caki-2中的表達(dá),并行qRT-PCR及Western blot進(jìn)行驗(yàn)證。4、采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PGAM1表達(dá)下調(diào)對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株RLC-310及Caki-2中凋亡的影響；同時(shí),采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGAM1表達(dá)下調(diào)對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株RLC-310及Caki-2增殖的影響。5、通過(guò)qRT-PCR及Western blot檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株RLC-310及Caki-2中PGAM1表達(dá)下調(diào)后,P53、Caspase 3及Caspase 9的表達(dá)情況,初步探討PGAM1發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制。結(jié)果1. PGAM1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)首先,我們通過(guò)免疫組化檢測(cè)了192例腎透明細(xì)胞癌組織及80例腎癌遠(yuǎn)端正�！I組織中PGAM1的表達(dá),結(jié)果表明PGAM1陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì),在正常腎組織及腎透明細(xì)胞癌組織中均可見陽(yáng)性表達(dá)。其中,正常腎組織中,陰性表達(dá)20例(25.0%),弱陽(yáng)性表達(dá)34例(42.5%),中度陽(yáng)性表達(dá)20例(25.0%),強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)6例(7.5%)；腎透明細(xì)胞癌組織中,陰性表達(dá)59例(30.7%),弱陽(yáng)性表達(dá)45例(23.4%),中度陽(yáng)性表達(dá)71例(37.0%),強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)17例(8.9%)；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,兩組差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1-1,P=0.017)。隨后,我們進(jìn)行了半定量分析,發(fā)現(xiàn)PGAM1在腎透明細(xì)胞癌中104例(54.2%)呈低表達(dá),88例(45.8%)呈高表達(dá)；在正常腎組織中,54例(67.5%)呈低表達(dá),26例(32.5%)呈高表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也顯示兩組差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1-2,P=0.044)。隨后,我們采用qRT-PCR定量檢測(cè)了三對(duì)腎透明細(xì)胞癌及配對(duì)遠(yuǎn)端正常腎組織中PGAM1mRNA的表達(dá),結(jié)果表明PGAM1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)約為正常腎組織中表達(dá)的4.2倍,明顯高于正常腎組織,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1-2,P=0.004)。 同時(shí),我們通過(guò)Western blot也定量檢測(cè)了8對(duì)腎透明細(xì)胞癌及配對(duì)正常腎組織中PGAM1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果表明PGAM1蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)為正常腎組織中的3.2倍,明顯高于正常腎組織,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1-2,P=0.001)同時(shí),我們也探討PGMA1在腎透明細(xì)胞癌表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示：PGMA1表達(dá)與年齡、腫瘤大小及T分期相關(guān),而與性別、腫瘤位置及吸煙史無(wú)明顯相關(guān)。其中,92例年齡57歲患者中12例患者PGMA1呈高表達(dá),其高表達(dá)率明顯低于57歲患者(43/100),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。58例腫瘤直徑≥5 cm患者中,34例患者呈高表達(dá),其高表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑5 cm的腫瘤患者(54/134),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0027)。80例T2-T3患者中,46例呈PGAM1高表達(dá),其高表達(dá)率明顯高于T1期患者,差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。2.腎透明細(xì)胞癌中PGAM1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系依據(jù)腎細(xì)胞癌患者的預(yù)后相關(guān)資料,我們采用Kaplan-Meier法探討了臨床病理特征與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果表明腎透明細(xì)胞癌患者的預(yù)后與PGAM1表達(dá)、腫瘤大小及T分期密切相關(guān)。其中,PGAM1高表達(dá)患者的平均生存時(shí)間為48月,明顯低于PGAM1低表達(dá)患者的平均生存時(shí)間(56月),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。同時(shí),結(jié)果顯示腫瘤直徑5 cm患者的術(shù)后平均生存時(shí)間為55月,明顯高于腫瘤直徑≥5 cm的患者(47月),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。T1患者的平均生存時(shí)間為55月,明顯高于T2-T3期患者(49月),差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。然而,年齡、性別、腫瘤位置及吸煙史與患者的預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)(P0.05)。隨后,我們探討了PGAM1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系對(duì)患者預(yù)后的影響。我們發(fā)現(xiàn)在年齡57歲的患者中,PGAM1高表達(dá)患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)患者(P=0.000)；而在年齡57歲的患者中,PGAM1表達(dá)與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)(P=0.203)。在男性患者中,PGAM1高表達(dá)患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)患者(P=-0.000)；同樣,在女性患者中,PGAM1高表達(dá)患者預(yù)后明顯較差(P=0.013)。在左側(cè)腎透明細(xì)胞癌中,PGAM1高表達(dá)患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)患者(P=0.000)；而在右側(cè)腎透明細(xì)胞癌中,PGAM1表達(dá)與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)(P=0.579)；在有吸煙史及無(wú)吸煙史患者中,PGAM1高表達(dá)患者預(yù)后均明顯差于低表達(dá)患者(P=0.000,P=0.006)。在腫瘤小于5cm的腎透明細(xì)胞癌患者中,PGAM1高表達(dá)患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)患者(P=0.000)；而在腫瘤5cm腎透明細(xì)胞癌中,PGAM1表達(dá)與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)(P=0.47)；在T1期腎透明細(xì)胞癌患者中,PGAM1高表達(dá)患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)患者(P=0.000)；而在T2-T3期腎透明細(xì)胞癌患者中,PGAM1表達(dá)與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)(P=0.945)。多因素回歸分析PGAM1及腫瘤大小可作為腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后評(píng)估的獨(dú)立因素,而T分期并不能作為腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后評(píng)估的獨(dú)立因素。3.敲低PGAM1表達(dá)對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響我們首先通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了PGAM1在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株RLC-310及Caki-2中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株RLC-310及Caki-2中均能檢測(cè)到PGAM1的表達(dá),其中RLC-310中的表達(dá)高于Caki-2。隨后,我們通過(guò)siRNA干擾技術(shù)將PGAM1干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了兩株細(xì)胞,并采用qRT-PCR及Western blot進(jìn)行了相應(yīng)的驗(yàn)證。qRT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染后,PGAM1在RLC-310及Caki-2細(xì)胞中的表達(dá)均明顯下調(diào),差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001,P=0.008),表明RLC-310及Caki-2中PGAM1表達(dá)被成功敲低,PGAM1干擾片段成功轉(zhuǎn)染。隨后,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)探討了PGM1表達(dá)下調(diào)對(duì)透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明在RLC-310細(xì)胞中,PGAM1表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞增殖時(shí)檢測(cè)到的OD值與對(duì)照組相比明顯降低(P=0.000),生長(zhǎng)曲線較平緩。同樣,在Caki-2細(xì)胞中,PGAM1表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞增殖時(shí)檢測(cè)到的OD值與對(duì)照組相比明顯降低(P=0.000),生長(zhǎng)曲線較平緩,表明PGAM1表達(dá)下調(diào)后Caki-2細(xì)胞增殖能力減弱。同時(shí),采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了PGAM1表達(dá)下調(diào)對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明：在RLC-310細(xì)胞中,PGAM1表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞的凋亡率為15.67%±0.52%,而對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為5.21%±1.04%,兩組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。在Caki-2細(xì)胞中,PGAM1表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞的凋亡率為11.83%±1.09%,而對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為4.81%±1.33%,兩組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。4. PGAM1表達(dá)下調(diào)發(fā)揮生物學(xué)功能相關(guān)機(jī)制的初步研究首先,我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了P53、Caspase 3及Caspase 9的在RLC-310腎透明癌細(xì)胞株中的表達(dá),結(jié)果顯示PGAM1表達(dá)下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase 9表達(dá)均明顯上調(diào),與對(duì)照組相比,差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨后,我們也檢測(cè)了P53、Caspase 3及Caspase 9的在Caki-2腎透明癌細(xì)胞株中的表達(dá),結(jié)果也顯示PGAM1表達(dá)下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase 9表達(dá)也均明顯上調(diào),與對(duì)照組相比,差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨后,為了進(jìn)一步證實(shí)PGAM1表達(dá)下調(diào)對(duì)P53、Caspase 3及Caspase 9的影響,我們通過(guò)Western blot進(jìn)行了相應(yīng)驗(yàn)證。在RLC-310腎透明癌細(xì)胞株中的,結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,PGAM1表達(dá)下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase 9表達(dá)均上調(diào)。經(jīng)灰度值檢測(cè)分析,表明PGAM1表達(dá)下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase9的OD值明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示GAM1在RLC-31表達(dá)下調(diào)后上調(diào)了P53、Caspase 3及Caspase 9表達(dá)。同樣,在Caki-2腎透明癌細(xì)胞株中的,結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,PGAM1表達(dá)下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase9表達(dá)均上調(diào)。經(jīng)灰度值檢測(cè)分析,表明PGAM1表達(dá)下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase 9的OD值明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示GAM1在Caki-2表達(dá)下調(diào)后上調(diào)了P53、Caspase 3及Caspase 9表達(dá)。結(jié)論：1.PGAM1在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于周圍正常腎組織,其在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。2. PGAM1表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者的臨床病理特征相關(guān),并影響患者的預(yù)后相關(guān),PGAM1可作為腎透明細(xì)胞癌預(yù)后評(píng)估的獨(dú)立因素。3. PGAM1表達(dá)下調(diào)具有促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡,抑制其增殖的生物學(xué)功能,其作用機(jī)制與P53/Caspase 3/Caspase 9信號(hào)通路相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.11

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7 尹森琴;鄭勇明;江時(shí)忠;朱斌;陳立忠;章明圖;;腎透明細(xì)胞癌的螺旋CT表現(xiàn)與病理對(duì)照研究[A];2007年浙江省放射學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

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9 徐麗偉;徐春媚;畢偉;董曉秋;;腎透明細(xì)胞癌超聲造影模式與其病理分化程度的相關(guān)性[A];中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第七屆全國(guó)腹部超聲學(xué)術(shù)會(huì)議學(xué)術(shù)論文匯編[C];2007年

10 鄭宇朋;;腎透明細(xì)胞癌三次轉(zhuǎn)移至鼻腔[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 張中橋;Survivin在腎透明細(xì)胞癌中起重要作用[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

2 王茜;隱瞞病情可能更會(huì)嚇壞患者,好心態(tài)是良藥[N];新華每日電訊;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 趙作輝;腎透明細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];山東大學(xué);2015年

2 王暉;腎透明細(xì)胞癌硬脂酰輔酶A去飽和酶I對(duì)AKT信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制的研究[D];上海交通大學(xué);2014年

3 葛南;MGMT基因表達(dá)在腎細(xì)胞癌治療中的作用研究[D];山東大學(xué);2015年

4 趙建軍;腎透明細(xì)胞癌中miR-630的表達(dá)及與其臨床生物學(xué)行為關(guān)系的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

5 王功成;~(131)I核素標(biāo)記B7-H3單抗靶向治療腎透明細(xì)胞癌實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2015年

6 夏秋媛;SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物亞基BRM在腎透明細(xì)胞癌中缺失及其機(jī)制研究[D];南京大學(xué);2014年

7 李春景;PGAM1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)、臨床意義及其功能研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

8 高宇;KLF6基因表達(dá)下調(diào)在腎透明細(xì)胞癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2016年

9 許力為;MiR-186-5p在腎透明細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成中作用的研究[D];浙江大學(xué);2016年

10 王明超;睪丸孤核受體4（TR4）在腎透明細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中作用及其機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 秦杰;腎透明細(xì)胞癌3、7、8、9、17號(hào)染色體的雜合性缺失研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2009年

2 丁家寶;E2F1及EGR-1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 郭巖松;ERCC1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 朱鑫;HDAC1及E2F1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 趙輝;DECT皮髓早期增強(qiáng)序列圖像對(duì)腎透明細(xì)胞癌的診斷價(jià)值[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

6 魏晉艷;能譜CT成像在腎透明細(xì)胞癌術(shù)前分級(jí)評(píng)估 中的價(jià)值研究[D];蘭州大學(xué);2015年

7 高裕;CREPT在腎透明細(xì)胞癌的作用機(jī)制研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

8 王鵬;緊密連接蛋claudin-4在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

9 牛少曦;miR-223在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)和作用[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

10 李金濤;腫瘤干細(xì)胞ALDH1和ABCG2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

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本文編號(hào)：2077861