本文選題：sorafenib + 原發(fā)性肝癌��； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：中晚期肝癌的主要治療手段是經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞(TACE)。TACE通過(guò)栓塞供血?jiǎng)用}造成腫瘤缺血缺氧,產(chǎn)生壞死。但TACE造成的腫瘤微環(huán)境乏氧(hypoxia)可誘導(dǎo)殘存的癌細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答反應(yīng),導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力提高。如何降低TACE后肝癌細(xì)胞的乏氧應(yīng)答成為提高TACE遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵。Sorafenib是一種多激酶抑制劑,具有多個(gè)治療靶點(diǎn),已被證實(shí)可以顯著延長(zhǎng)肝癌患者的生存時(shí)間。將sorafenib與TACE結(jié)合能否進(jìn)一步提高患者的預(yù)后是目前臨床研究的熱點(diǎn)。有研究顯示二者聯(lián)合會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),但具體機(jī)制不明,sorafenib是否通過(guò)抑制肝癌的乏氧應(yīng)答來(lái)提高TACE的療效尚不十分清楚。此外,sorafenib雖然可以延長(zhǎng)肝癌患者的生存時(shí)間,但在治療的反應(yīng)率方面卻并不突出,部分獲益患者的腫瘤甚至一直在增長(zhǎng)。如何準(zhǔn)確的反映和評(píng)價(jià)sorafenib的療效,需要我們尋找新的評(píng)價(jià)手段和方法。Sorafenib作為一種靶向治療藥物,價(jià)格昂貴,如能早期判定其對(duì)某個(gè)特定患者是否起效以及何種劑量下起效,臨床上可以指導(dǎo)無(wú)效患者盡早停藥及更換藥物,減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān);對(duì)于因服藥副反應(yīng)嚴(yán)重而需要減量的患者,可以監(jiān)測(cè)并指導(dǎo)合理的用藥劑量。針對(duì)上述問(wèn)題,本研究課題擬從以下三個(gè)方面進(jìn)行系統(tǒng)性研究。一、Sorafenib對(duì)肝癌細(xì)胞乏氧應(yīng)答的干預(yù)作用研究材料和方法:人肝癌SMMC-7721細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至70%融合后,分成如下三組:(1)正常條件培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞;(2)乏氧培養(yǎng)24h的SMMC-7721細(xì)胞;(3)加入sorafenib(4μmol/L)預(yù)處理的SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行乏氧培養(yǎng)24h。采用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布;細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞粘附性變化;Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲性變化。結(jié)果:(1)細(xì)胞增殖活性顯示:乏氧培養(yǎng)組(150μM Co Cl2,24h)與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖能力略有增加,但差異不顯著(P0.05),sorafenib(4μmol/L 1h)預(yù)處理后再乏氧培養(yǎng)組與對(duì)照組及乏氧培養(yǎng)組相比,細(xì)胞增殖能力降低,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(2)細(xì)胞周期檢測(cè)顯示:乏氧培養(yǎng)組(150μM Co Cl2,24h)與對(duì)照組相比S期細(xì)胞比例降低,G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例增加;sorafenib處理組與對(duì)照組相比,S期細(xì)胞也有所降低,但差異均不顯著(P0.05),而G0/G1期細(xì)胞顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),G2/M期細(xì)胞幾乎無(wú)改變;sorafenib處理組與乏氧培養(yǎng)組比較,S期細(xì)胞比例有所升高,接近對(duì)照組水平,而G2/M期細(xì)胞則明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與對(duì)照組接近。(3)細(xì)胞粘附能力顯示:乏氧培養(yǎng)組的細(xì)胞粘附能力與對(duì)照組相比略有增加,經(jīng)sorafenib處理后,細(xì)胞粘附力顯著降低,差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。(4)Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示:乏氧培養(yǎng)組(150μM Co Cl2,24h)與對(duì)照組相比細(xì)胞侵襲力降低(P0.05);sorafenib預(yù)處理組與對(duì)照組及乏氧組相比,細(xì)胞侵襲力均有非常明顯降低,差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:(1)乏氧可誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生乏氧應(yīng)答,表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖及粘附能力增強(qiáng),細(xì)胞周期G0/G1期和G2/M期阻滯。(2)SMMC-7721肝癌細(xì)胞在sorafenib預(yù)處理后再進(jìn)行乏氧培養(yǎng),其乏氧應(yīng)答反應(yīng)被明顯抑制,表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖及粘附能力降低,細(xì)胞周期阻滯部分逆轉(zhuǎn),侵襲能力進(jìn)一步降低等,證實(shí)sorafenib在抑制人肝癌細(xì)胞乏氧應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。二、Sorafenib抑制乏氧肝癌細(xì)胞活體致瘤能力的實(shí)驗(yàn)研究材料和方法:采用體外GFP(綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細(xì)胞,嘌呤霉素殺滅進(jìn)行SMMC-7721-GFP穩(wěn)定細(xì)胞株篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的SMMC-7721細(xì)胞株。將16只BALB/c裸鼠隨機(jī)分成4組,每組4只,用1ml注射器于每只裸鼠背部皮下注射約2×106個(gè)接受不同條件處理的SMMC-7721-GFP細(xì)胞。A組裸鼠注射正常條件培養(yǎng)的SMMC-7721-GFP細(xì)胞;B組裸鼠注射乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721-GFP細(xì)胞;C組裸鼠注射sorafenib預(yù)處理后再乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721-GFP細(xì)胞;D組裸鼠按照C組條件處理后的裸鼠再每日喂食sorafenib。對(duì)各組裸鼠分別在腫瘤接種的第2、9、16、23、30和40天時(shí)采用游標(biāo)卡尺體外測(cè)量裸鼠瘤灶的長(zhǎng)與寬,計(jì)算腫瘤體積,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線,40天后處死裸鼠,取出腫瘤稱重并進(jìn)行VEGF、CD34免疫組化染色。結(jié)果:嘌呤霉素殺滅曲線確定殺滅全部未感染病毒細(xì)胞的最小濃度為4ug/ml。按照此濃度的嘌呤霉素篩選4代獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的SMMC-7721細(xì)胞株,經(jīng)不同的預(yù)處理后注入裸鼠皮下成瘤。(1)腫瘤體積比較:成瘤第23天時(shí)D組裸鼠瘤體積較A組(對(duì)照組)明顯小(P0.05);成瘤30天時(shí),C組裸鼠瘤體積與A組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);至成瘤40天時(shí),D組及C組裸鼠的成瘤體積與A組相比差異均有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);B組裸鼠在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的成瘤體積上與A組相比差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)腫瘤重量比較:裸鼠成瘤40天時(shí),D組裸鼠瘤重量明顯低于其他三組,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而各組裸鼠的總體重在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)免疫組化結(jié)果比較:相對(duì)于A組,B組VEGF及CD34的表達(dá)較A組略有增高,而C則較A組略有減低,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);D組裸鼠相對(duì)于A組VEGF及CD34的表達(dá)明顯減低,差異均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01),顯示了sorafenib預(yù)處理及持續(xù)胃灌藥可以顯著抑制VEGF及CD34的表達(dá)。結(jié)論:(1)通過(guò)構(gòu)建GFP熒光慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細(xì)胞,通過(guò)嘌呤霉素篩選可以獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的SMMC-7721細(xì)胞株。(2)裸鼠活體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示,乏氧處理的瘤細(xì)胞隨著sorafenib作用時(shí)間的延長(zhǎng),抑瘤作用更加明顯。(3)基于成瘤標(biāo)本的VEGF與CD34免疫組化對(duì)照研究,進(jìn)一步驗(yàn)證了持續(xù)應(yīng)用sorafenib可通過(guò)抑制腫瘤的血管生成及粘附侵襲能力而達(dá)到聯(lián)合治療腫瘤的效果。三、光學(xué)分子成像活體監(jiān)測(cè)成瘤生長(zhǎng)及評(píng)價(jià)sorafenib早期療效的研究材料和方法:人肝癌SMMC-7721細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至70%融合后,按照實(shí)驗(yàn)第一部分方法分成三組進(jìn)行預(yù)處理。12只BALB/c裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成4組,每組3只,在裸鼠背部皮下注射成瘤。A組裸鼠:注射正常條件培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞;B組裸鼠:注射乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞;C組裸鼠:注射sorafenib預(yù)處理后乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞;D組裸鼠:按照C組條件處理后的裸鼠再每日喂食sorafenib。對(duì)接種的裸鼠分別在腫瘤接種第2、9、16、23、30和40天在熒光活體成像儀(IVIS LuminaⅡ)下進(jìn)行活體成像,通過(guò)熒光強(qiáng)度觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況及致瘤率,游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠瘤灶的長(zhǎng)與寬,計(jì)算腫瘤體積(mm3)并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。皮下成瘤40天時(shí)采用熒光染料Cy5.5標(biāo)記的Annexin V注入裸鼠體內(nèi),應(yīng)用小動(dòng)物活體成像儀(IVIS LuminaⅡ)在480nm和520nm的條件下捕捉小鼠體內(nèi)發(fā)出的特異光子,進(jìn)行腫瘤凋亡顯像,通過(guò)IOD值反映腫瘤的凋亡情況并比較各組之間的凋亡差異。結(jié)果:(1)活體光學(xué)顯像監(jiān)測(cè)成瘤情況:各組裸鼠成瘤情況通過(guò)吸光度值檢測(cè)結(jié)果顯示,皮下成瘤30天后可以通過(guò)吸光度值的測(cè)定較準(zhǔn)確的反映出種植瘤的生長(zhǎng)變化情況,至40天時(shí)吸光度值測(cè)定結(jié)果顯示:A組和B組裸鼠的吸光度值基本一致,而C組的吸光度值則相對(duì)較小,D組的吸光度值最小,這四組的吸光度值變化趨勢(shì)與游標(biāo)卡尺體外測(cè)量的結(jié)果相符。(2)活體光學(xué)成像評(píng)價(jià)sorafenib早期治療腫瘤細(xì)胞凋亡情況:相對(duì)于對(duì)照組(A組),Co Cl2乏氧處理組(B組)和sorafenib預(yù)處理組(C組)的腫瘤細(xì)胞凋亡程度略有增高,但差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Sorafenib預(yù)處理后繼續(xù)胃灌藥組(D組)可以顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,吸光度值達(dá)到9.165×1010,與A組相比(吸光度值3.897×109)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:(1)GFP熒光標(biāo)記的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤情況可通過(guò)GFP活體熒光成像來(lái)顯示和監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況,并可通過(guò)吸光度值的變化評(píng)估和比較腫瘤大小。(2)采用Cy5.5標(biāo)記的Annexin V能夠靶向結(jié)合到腫瘤凋亡細(xì)胞上,并可通過(guò)分子光學(xué)成像顯影和定量評(píng)估。(3)Sorafenib對(duì)肝癌的治療效果至少可以在40天時(shí)通過(guò)Cy5.5標(biāo)記Annexin V的凋亡光學(xué)分子成像技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)和判斷其療效。
[Abstract]:In order to improve the survival time of patients with hepatocellular carcinoma ( HCC ) , it has been proved that there is no significant difference ( P < 0.05 ) , sordid ( 4 渭mol / L 1h ) , and the control group and hypoxic culture group . ( 2 ) Cell cycle test showed that the percentage of S phase cells decreased , G0 / G1 phase and G2 / M phase increased significantly compared with control group ( P0.05 ) . The results showed that the tumor volume and invasion ability of nude mice were significantly lower than those in group A ( P0.05 ) . The results were as follows : ( 1 ) The nude mice were injected into nude mice at 480 nm and 520 nm . ( 2 ) In vivo optical imaging , the apoptosis of tumor cells was significantly increased compared with control group ( group A ) , Co _ 2 - deficient oxygen treatment group ( group B ) and sordid pretreatment group ( group C ) .
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2076015