本文選題：sorafenib + 原發(fā)性肝癌��； 參考：《大連醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：中晚期肝癌的主要治療手段是經(jīng)肝動脈化療栓塞(TACE)。TACE通過栓塞供血動脈造成腫瘤缺血缺氧,產(chǎn)生壞死。但TACE造成的腫瘤微環(huán)境乏氧(hypoxia)可誘導殘存的癌細胞產(chǎn)生適應性應答反應,導致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力提高。如何降低TACE后肝癌細胞的乏氧應答成為提高TACE遠期療效的關(guān)鍵。Sorafenib是一種多激酶抑制劑,具有多個治療靶點,已被證實可以顯著延長肝癌患者的生存時間。將sorafenib與TACE結(jié)合能否進一步提高患者的預后是目前臨床研究的熱點。有研究顯示二者聯(lián)合會產(chǎn)生協(xié)同效應,但具體機制不明,sorafenib是否通過抑制肝癌的乏氧應答來提高TACE的療效尚不十分清楚。此外,sorafenib雖然可以延長肝癌患者的生存時間,但在治療的反應率方面卻并不突出,部分獲益患者的腫瘤甚至一直在增長。如何準確的反映和評價sorafenib的療效,需要我們尋找新的評價手段和方法。Sorafenib作為一種靶向治療藥物,價格昂貴,如能早期判定其對某個特定患者是否起效以及何種劑量下起效,臨床上可以指導無效患者盡早停藥及更換藥物,減輕患者的經(jīng)濟負擔;對于因服藥副反應嚴重而需要減量的患者,可以監(jiān)測并指導合理的用藥劑量。針對上述問題,本研究課題擬從以下三個方面進行系統(tǒng)性研究。一、Sorafenib對肝癌細胞乏氧應答的干預作用研究材料和方法:人肝癌SMMC-7721細胞常規(guī)培養(yǎng)至70%融合后,分成如下三組:(1)正常條件培養(yǎng)的SMMC-7721細胞;(2)乏氧培養(yǎng)24h的SMMC-7721細胞;(3)加入sorafenib(4μmol/L)預處理的SMMC-7721細胞進行乏氧培養(yǎng)24h。采用CCK-8檢測各組細胞的增殖活性;流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期分布;細胞粘附實驗檢測各組細胞粘附性變化;Boyden小室侵襲實驗檢測各組細胞侵襲性變化。結(jié)果:(1)細胞增殖活性顯示:乏氧培養(yǎng)組(150μM Co Cl2,24h)與對照組相比細胞增殖能力略有增加,但差異不顯著(P0.05),sorafenib(4μmol/L 1h)預處理后再乏氧培養(yǎng)組與對照組及乏氧培養(yǎng)組相比,細胞增殖能力降低,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)。(2)細胞周期檢測顯示:乏氧培養(yǎng)組(150μM Co Cl2,24h)與對照組相比S期細胞比例降低,G0/G1期和G2/M期細胞比例增加;sorafenib處理組與對照組相比,S期細胞也有所降低,但差異均不顯著(P0.05),而G0/G1期細胞顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),G2/M期細胞幾乎無改變;sorafenib處理組與乏氧培養(yǎng)組比較,S期細胞比例有所升高,接近對照組水平,而G2/M期細胞則明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),與對照組接近。(3)細胞粘附能力顯示:乏氧培養(yǎng)組的細胞粘附能力與對照組相比略有增加,經(jīng)sorafenib處理后,細胞粘附力顯著降低,差異具有極顯著統(tǒng)計學意義(P0.001)。(4)Boyden小室侵襲實驗顯示:乏氧培養(yǎng)組(150μM Co Cl2,24h)與對照組相比細胞侵襲力降低(P0.05);sorafenib預處理組與對照組及乏氧組相比,細胞侵襲力均有非常明顯降低,差異具有明顯統(tǒng)計學意義(P0.01)。結(jié)論:(1)乏氧可誘導人肝癌SMMC-7721細胞產(chǎn)生乏氧應答,表現(xiàn)為腫瘤細胞增殖及粘附能力增強,細胞周期G0/G1期和G2/M期阻滯。(2)SMMC-7721肝癌細胞在sorafenib預處理后再進行乏氧培養(yǎng),其乏氧應答反應被明顯抑制,表現(xiàn)為腫瘤細胞增殖及粘附能力降低,細胞周期阻滯部分逆轉(zhuǎn),侵襲能力進一步降低等,證實sorafenib在抑制人肝癌細胞乏氧應答中發(fā)揮重要作用。二、Sorafenib抑制乏氧肝癌細胞活體致瘤能力的實驗研究材料和方法:采用體外GFP(綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細胞,嘌呤霉素殺滅進行SMMC-7721-GFP穩(wěn)定細胞株篩選,獲得穩(wěn)定表達GFP的SMMC-7721細胞株。將16只BALB/c裸鼠隨機分成4組,每組4只,用1ml注射器于每只裸鼠背部皮下注射約2×106個接受不同條件處理的SMMC-7721-GFP細胞。A組裸鼠注射正常條件培養(yǎng)的SMMC-7721-GFP細胞;B組裸鼠注射乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721-GFP細胞;C組裸鼠注射sorafenib預處理后再乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721-GFP細胞;D組裸鼠按照C組條件處理后的裸鼠再每日喂食sorafenib。對各組裸鼠分別在腫瘤接種的第2、9、16、23、30和40天時采用游標卡尺體外測量裸鼠瘤灶的長與寬,計算腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線,40天后處死裸鼠,取出腫瘤稱重并進行VEGF、CD34免疫組化染色。結(jié)果:嘌呤霉素殺滅曲線確定殺滅全部未感染病毒細胞的最小濃度為4ug/ml。按照此濃度的嘌呤霉素篩選4代獲得穩(wěn)定表達GFP的SMMC-7721細胞株,經(jīng)不同的預處理后注入裸鼠皮下成瘤。(1)腫瘤體積比較:成瘤第23天時D組裸鼠瘤體積較A組(對照組)明顯小(P0.05);成瘤30天時,C組裸鼠瘤體積與A組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);至成瘤40天時,D組及C組裸鼠的成瘤體積與A組相比差異均有極顯著統(tǒng)計學意義(P0.001);B組裸鼠在各時間節(jié)點的成瘤體積上與A組相比差異無明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)腫瘤重量比較:裸鼠成瘤40天時,D組裸鼠瘤重量明顯低于其他三組,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01),而各組裸鼠的總體重在各個時間節(jié)點的差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)免疫組化結(jié)果比較:相對于A組,B組VEGF及CD34的表達較A組略有增高,而C則較A組略有減低,但差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05);D組裸鼠相對于A組VEGF及CD34的表達明顯減低,差異均具有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05,P0.01),顯示了sorafenib預處理及持續(xù)胃灌藥可以顯著抑制VEGF及CD34的表達。結(jié)論:(1)通過構(gòu)建GFP熒光慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細胞,通過嘌呤霉素篩選可以獲得穩(wěn)定表達GFP的SMMC-7721細胞株。(2)裸鼠活體內(nèi)成瘤實驗顯示,乏氧處理的瘤細胞隨著sorafenib作用時間的延長,抑瘤作用更加明顯。(3)基于成瘤標本的VEGF與CD34免疫組化對照研究,進一步驗證了持續(xù)應用sorafenib可通過抑制腫瘤的血管生成及粘附侵襲能力而達到聯(lián)合治療腫瘤的效果。三、光學分子成像活體監(jiān)測成瘤生長及評價sorafenib早期療效的研究材料和方法:人肝癌SMMC-7721細胞常規(guī)培養(yǎng)至70%融合后,按照實驗第一部分方法分成三組進行預處理。12只BALB/c裸鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分成4組,每組3只,在裸鼠背部皮下注射成瘤。A組裸鼠:注射正常條件培養(yǎng)的SMMC-7721細胞;B組裸鼠:注射乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721細胞;C組裸鼠:注射sorafenib預處理后乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721細胞;D組裸鼠:按照C組條件處理后的裸鼠再每日喂食sorafenib。對接種的裸鼠分別在腫瘤接種第2、9、16、23、30和40天在熒光活體成像儀(IVIS LuminaⅡ)下進行活體成像,通過熒光強度觀察腫瘤的生長情況及致瘤率,游標卡尺測量裸鼠瘤灶的長與寬,計算腫瘤體積(mm3)并繪制腫瘤生長曲線。皮下成瘤40天時采用熒光染料Cy5.5標記的Annexin V注入裸鼠體內(nèi),應用小動物活體成像儀(IVIS LuminaⅡ)在480nm和520nm的條件下捕捉小鼠體內(nèi)發(fā)出的特異光子,進行腫瘤凋亡顯像,通過IOD值反映腫瘤的凋亡情況并比較各組之間的凋亡差異。結(jié)果:(1)活體光學顯像監(jiān)測成瘤情況:各組裸鼠成瘤情況通過吸光度值檢測結(jié)果顯示,皮下成瘤30天后可以通過吸光度值的測定較準確的反映出種植瘤的生長變化情況,至40天時吸光度值測定結(jié)果顯示:A組和B組裸鼠的吸光度值基本一致,而C組的吸光度值則相對較小,D組的吸光度值最小,這四組的吸光度值變化趨勢與游標卡尺體外測量的結(jié)果相符。(2)活體光學成像評價sorafenib早期治療腫瘤細胞凋亡情況:相對于對照組(A組),Co Cl2乏氧處理組(B組)和sorafenib預處理組(C組)的腫瘤細胞凋亡程度略有增高,但差異無明顯統(tǒng)計學意義(P0.05);Sorafenib預處理后繼續(xù)胃灌藥組(D組)可以顯著誘導腫瘤細胞的凋亡,吸光度值達到9.165×1010,與A組相比(吸光度值3.897×109)差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:(1)GFP熒光標記的人肝癌SMMC-7721細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤情況可通過GFP活體熒光成像來顯示和監(jiān)測腫瘤的生長情況,并可通過吸光度值的變化評估和比較腫瘤大小。(2)采用Cy5.5標記的Annexin V能夠靶向結(jié)合到腫瘤凋亡細胞上,并可通過分子光學成像顯影和定量評估。(3)Sorafenib對肝癌的治療效果至少可以在40天時通過Cy5.5標記Annexin V的凋亡光學分子成像技術(shù)進行檢測和判斷其療效。
[Abstract]:In order to improve the survival time of patients with hepatocellular carcinoma ( HCC ) , it has been proved that there is no significant difference ( P < 0.05 ) , sordid ( 4 渭mol / L 1h ) , and the control group and hypoxic culture group . ( 2 ) Cell cycle test showed that the percentage of S phase cells decreased , G0 / G1 phase and G2 / M phase increased significantly compared with control group ( P0.05 ) . The results showed that the tumor volume and invasion ability of nude mice were significantly lower than those in group A ( P0.05 ) . The results were as follows : ( 1 ) The nude mice were injected into nude mice at 480 nm and 520 nm . ( 2 ) In vivo optical imaging , the apoptosis of tumor cells was significantly increased compared with control group ( group A ) , Co _ 2 - deficient oxygen treatment group ( group B ) and sordid pretreatment group ( group C ) .
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：2076014