本文選題：2型糖尿病 + 乳腺癌　； 參考：《天津醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：目的:近來人們發(fā)現(xiàn)糖尿病與部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在女性2型糖尿病患者中,乳腺癌發(fā)病率顯著高于非糖尿病患者。已有文獻報道,二甲雙胍可通過激活AMPK信號轉導通路改善乳腺癌患者的預后。利拉魯肽是GLP-1的類似物,已廣泛應用于糖尿病患者的降糖治療。利拉魯肽可通過激活AMPK信號轉導通路發(fā)揮降糖以外生物學作用。那么,利拉魯肽是否亦可通過激活AMPK信號轉導通路影響乳腺癌細胞的增殖、凋亡尚不清楚。miR-27a有原癌基因活性,在乳腺癌,胃癌,結腸癌,子宮內膜癌等多種腫瘤細胞中呈高表達,具有調控乳腺癌細胞凋亡及細胞周期等功能。Targetscan網(wǎng)站預測AMPKa2可能是miR-27a的靶基因。AMPKa2表達在乳腺癌細胞MCF-7中廣泛受到抑制,具有腫瘤抑制因子的作用。綜上所述,利拉魯肽是否可以通過影響miR-27a表達,進而上調AMPKa2表達,發(fā)揮抗腫瘤作用目前并不清楚。因此在我們研究中,以MCF-7(人乳腺癌)細胞為研究對象,探討利拉魯肽對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響,并從miRNA層面探索其可能機制。方法:1.不同濃度利拉魯肽(10n M、100n M、1000n M、10000n M)干預MCF-7細胞48h,應用CCK-8方法檢測MCF-7細胞增殖抑制率。2.給予MCF-7細胞1000n M利拉魯肽干預24h、48h、72h,應用CCK-8方法檢測MCF-7細胞增殖抑制率。3.給予MCF-7細胞1000n M利拉魯肽干預48h,應用平板克隆形成實驗檢測人乳腺癌MCF-7細胞克隆形成率;應用流式細胞儀檢測MCF-7細胞早期和晚期凋亡率。4.不同濃度利拉魯肽(10n M、100n M、1000n M)干預MCF-7細胞48h,應用實時熒光定量PCR方法檢測MCF-7細胞miR-27a及AMPKα2 m RNA表達水平;應用Western Blotting方法檢測AMPKα2蛋白表達水平。5.miR-27a mimics和inhibitor轉染MCF-7細胞48h,應用實時熒光定量PCR和Western Blotting方法檢測MCF-7細胞AMPKα2表達水平。6.雙熒光素報告酶基因分析實驗驗證miR-27a可結合AMPKα2 3’-UTR。7.miR-27a mimics和inhibitor轉染MCF-7細胞48h,應用CCK-8方法檢測MCF-7細胞光密度值,并計算細胞增殖抑制率;應用流式細胞儀檢測MCF-7細胞早期和晚期凋亡率;應用Western Blotting方法檢測PCNA、caspase-3蛋白表達水平。結果:1.不同濃度利拉魯肽(10n M、100n M、1000n M、10000n M)干預MCF-7細胞48h,MCF-7細胞增殖抑制率分別為10.3%,37.34%,58.8%,以及89.27%,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。2.給予MCF-7細胞1000n M利拉魯肽干預24h、48h、72h,MCF-7細胞增殖抑制率分別為13.11%,45.3%以及53.59%,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。3.給予MCF-7細胞1000n M利拉魯肽干預48h,MCF-7細胞克隆形成率為對照組的69.37%(P0.05);早期、晚期凋亡率分別為1.26%±0.18%、6.06%±0.32%,與空載體組(0.81%±0.13%、4.27%±0.26%)比較,兩組晚期凋亡率存在統(tǒng)計學差異(P0.05)。4.不同濃度利拉魯肽(10n M、100n M、1000n M)干預MCF-7細胞48h,miR-27a表達較對照組分別降低15.5%、44.5%、61.8%;AMPKα2 m RNA表達較對照組分別增加1.61倍、6.63倍和9.25倍;AMPKα2蛋白表達分別增加1.5倍、4.0倍和6.8倍,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.雙熒光素酶報告基因實驗顯示,AMPKα2野生型3'UTR基因報告質粒與miR-27a共轉染后,熒光素酶活性明顯降低(P0.05)。6.miR-27a mimics轉染MCF-7細胞48h,miR-27a表達量約為陰性對照組3.33倍;AMPKα2 m RNA、蛋白表達分別下調57.77%、52.55%(P0.05);miR-27a inhibitor轉染MCF-7細胞48h,miR-27a表達量為陰性對照組的43.19%;AMPKα2m RNA、蛋白表達分別增加1.61倍、2.27倍(P0.05)。7.miR-27a mimics轉染MCF-7細胞48h,兩組早期、晚期凋亡率分別為0.79%±0.09%、2.16%±0.41%,與空載體組(0.88%±0.11%、4.71%±0.23%)比較,晚期凋亡百分比差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05);PCNA蛋白表達增加2倍、caspase-3蛋白表達降低28.56%(P0.05)。miR-27a inhibitor轉染MCF-7細胞48h,miR-27a inhibitor組的增殖抑制率為56.78%±2.24%。兩組早期、晚期凋亡率分別為1.31%±0.07%、6.91%±0.27%,與空載體組(0.88%±0.11%、4.71%±0.23%)比較,兩組晚期凋亡百分比差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05);PCNA蛋白表達減低43.22%、caspase-3蛋白表達增加2.1倍(P0.05)。結論:利拉魯肽抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖作用呈濃度依賴性和時間依賴性,且能促進MCF-7細胞凋亡,其機制可能與利拉魯肽下調miR-27a表達,通過miR-27a靶基因AMPKα2表達水平上調來抑制PCNA表達,及促進caspase-3表達來發(fā)揮抗乳腺癌作用相關。
[Abstract]:Objective: Recently, people have found that diabetes is closely related to the development of some tumors. In women with type 2 diabetes, the incidence of breast cancer is significantly higher than that in non diabetic patients. It has been reported that metformin can improve the prognosis of breast cancer patients by activating the AMPK signal transduction pathway. It is used in diabetic patients with hypoglycemic therapy. By activating the AMPK signal transduction pathway, it can play a biological role other than hypoglycemic. Then, whether Leila Lou can also affect the proliferation of breast cancer cells by activating the AMPK signal transduction pathway, it is not clear that.MiR-27a has the proto oncogene activity in breast, gastric and colon cancer. A variety of tumor cells, such as endometrial cancer, are highly expressed, and the.Targetscan site that regulates the apoptosis and cell cycle of breast cancer cells predicts that AMPKa2 may be the target gene of miR-27a, which is widely suppressed in the MCF-7 of breast cancer cells and has the role of tumor suppressor. It is not clear that the expression of miR-27a, and then up regulation of AMPKa2 expression, and the antitumor effect is not clear. Therefore, in our study, the effects of rrrru on the proliferation and apoptosis of breast cancer cells were studied with MCF-7 (human breast cancer) cells, and the possible mechanisms were explored from the miRNA level. Methods: 1. different concentrations of rrrru (10N M, 100N) M, 1000N M, 10000n M) interfered MCF-7 cell 48h, and CCK-8 method was used to detect the proliferation inhibition rate of MCF-7 cells. The rate of cell clone formation was detected by using flow cytometry to detect the early and late apoptosis rate of MCF-7 cells with different concentrations of Liraru peptide (10N M, 100N M, 1000N M) in MCF-7 cell 48h. The expression level of MCF-7 cells and alpha 2 was detected by real-time fluorescent quantitative PCR method, and the expression level of alpha 2 protein was detected by using the method of real-time fluorescent quantitative PCR. .5.miR-27a mimics and inhibitor transfected MCF-7 cells 48h, real-time fluorescent quantitative PCR and Western Blotting methods were used to detect the expression level of AMPK alpha 2 in MCF-7 cells,.6. double fluorescein reporter gene analysis experiment verified miR-27a can be combined with alpha 23 'and transfected cells The cell light density value and the cell proliferation inhibition rate were calculated. The early and late apoptosis rates of MCF-7 cells were detected by flow cytometry, and the expression of PCNA and caspase-3 protein was detected by Western Blotting. Results: 1. the proliferation inhibition rate of 10N M, 100N M, 1000N M, 10000n cells were 10, respectively. .3%, 37.34%, 58.8%, and 89.27%, with statistical difference (P0.05).2. gave MCF-7 cells 1000N M Li La Lu peptide intervention 24h, 48h, 72h, MCF-7 cell proliferation inhibition rate was 13.11%, 45.3% and 53.59%, respectively. (P0.05); the early stage of apoptosis was 1.26% + 0.18% and 6.06% + 0.32% respectively. Compared with the unloaded body group (0.81% + 0.13%, 4.27% + 0.26%), the late apoptotic rate of the two groups was statistically different (P0.05).4. different concentrations of alalu peptide (10N M, 100N M, 1000N M) intervened MCF-7 cell 48h, miR-27a expression decreased 15.5%, 44.5%, 61.8%, respectively. The expression of NA was 1.61 times, 6.63 times and 9.25 times more than that of the control group, and the expression of AMPK alpha 2 protein increased by 1.5 times, 4 times and 6.8 times respectively. The difference was statistically significant (P0.05).5. double luciferase reporter gene experiment showed that the luciferase activity of AMPK a 2 wild type 3'UTR gene reporter plasmid was significantly reduced (P0.05).6.miR-27a (P0.05).6.miR-27a after CO transfection. Mimics transfected MCF-7 cells 48h, the expression of miR-27a was about 3.33 times that of negative control group, AMPK alpha 2 m RNA, protein expression down 57.77%, 52.55% (P0.05), miR-27a inhibitor transfected to MCF-7 cell 48h, and the expression amount was 43.19% of negative control group. 7 cell 48h, early stage of two group, the late apoptosis rate was 0.79% + 0.09%, 2.16% + 0.41% respectively. Compared with the unloaded body group (0.88% + 0.11%, 4.71% + 0.23%), the percentage of late apoptosis was statistically significant (P0.05), the expression of PCNA protein increased by 2 times, the expression of caspase-3 protein decreased (P0.05).MiR-27a inhibitor transfection to MCF-7 cells 48h, miR-27a inhibi. The proliferation inhibition rate of group tor was 56.78% + 2.24%. two groups, the late apoptosis rate was 1.31% + 0.07%, 6.91% + 0.27% respectively. Compared with the no-load group (0.88% + 0.11%, 4.71% + 0.23%), the percentage of late apoptosis in group two was statistically significant (P0.05); PCNA protein expression decreased 43.22%, caspase-3 protein expression increased significantly (P0.05). Conclusion: lila The inhibitory effect of RUP on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells is both concentration dependent and time dependent, and can promote the apoptosis of MCF-7 cells. The mechanism may be related to the downregulation of miR-27a expression with ralalurin, the up-regulation of AMPK alpha 2 expression level of miR-27a target gene to inhibit the expression of PCNA and promote the expression of Caspase-3 to play the role of anti breast cancer.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2071003