本文選題：肝癌 + 治療��； 參考：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：全球肝癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第6位,死亡率位居第3位。肝癌的治療是以手術(shù)為主的綜合治療。由于肝癌病情的發(fā)展速度較快,且一些患者當(dāng)明確臨床診斷時(shí)已經(jīng)失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì),所以對(duì)于肝癌的治療方法一直是醫(yī)生與科研學(xué)者們探討的熱點(diǎn),人們努力尋找新的治療方法。近些年對(duì)于肝癌的治療得到了一定的發(fā)展,除手術(shù)治療外人們通過對(duì)腫瘤發(fā)生相關(guān)基因的靶向打擊,腫瘤細(xì)胞生存代謝的通路打擊,腫瘤細(xì)胞生存微環(huán)境的調(diào)節(jié)等多種方式對(duì)肝癌進(jìn)行治療。在實(shí)驗(yàn)室研究中,學(xué)者們不斷地在探索,也取得了一定的成果,但這些進(jìn)步還需要繼續(xù)完善、轉(zhuǎn)化、創(chuàng)新,希望能夠得到最強(qiáng)的抑制腫瘤,甚至徹底消滅腫瘤,但不能夠?qū)θ梭w正常細(xì)胞、組織帶來大的傷害的方法。目前對(duì)肝癌的靶向治療是學(xué)者們研究的熱點(diǎn),如利用抑癌基因去抑制腫瘤細(xì)胞生存,利用打擊癌基因使其失去促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展,通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞血管生成,抑制腫瘤營(yíng)養(yǎng),促進(jìn)腫瘤壞死。改變腫瘤細(xì)胞黏附能力,使其不能夠定植,減弱轉(zhuǎn)移能力。Endocan基因在文獻(xiàn)報(bào)道中顯示了與腫瘤細(xì)胞及腫瘤血管生成間存在著密切的關(guān)系。它可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,可以促進(jìn)癌灶內(nèi)、外血管的生成,進(jìn)而為腫瘤細(xì)胞的存活提供營(yíng)養(yǎng)支持。為了探討Endocan基因是否能夠成為肝癌治療的靶點(diǎn),本研究設(shè)計(jì)了如下的實(shí)驗(yàn)流程:1.選擇Endocan基因沉默效果最佳的RNA干擾序列。在這節(jié)實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了3條RNA干擾序列和1條陰性對(duì)照序列,通過質(zhì)粒為載體將其轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞SH-HEP-1中,通過各組間Endocan基因及蛋白表達(dá)檢測(cè),以干擾后基因及蛋白表達(dá)最少的組別視為干擾效果做好,選取干擾效果最佳的干擾序列進(jìn)行以下各步實(shí)驗(yàn)。2.通過MTT和Transwell小室實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)Endocan基因沉默后肝癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力的改變。在這節(jié)中通過未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陰性對(duì)照組(Control組)、RNAi組(si RNA組)、陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(NC組)進(jìn)行對(duì)照,通過MTT法測(cè)定各組0h、24h、48h、72h、96h時(shí)間點(diǎn)OD值,OD值低的組別則表示增殖能力弱,通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)成功侵襲的細(xì)胞。通過以上方法觀察si RNA組的細(xì)胞增殖能力和侵襲能力能發(fā)生的變化。3.Endocan基因沉默后對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種重要的程序性死亡方式,在這節(jié)中利用凋亡檢測(cè)試劑盒,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡的方法,對(duì)Control組、si RNA組、NC組細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè),觀察當(dāng)Endocan基因被沉默后是否會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡的發(fā)生。4.Endocan基因沉默后對(duì)肝癌細(xì)胞自噬的影響。自噬性死亡是與凋亡并存的另一種細(xì)胞程序性死亡方式,在這節(jié)中通過檢測(cè)自噬相關(guān)的蛋白的表達(dá)量,對(duì)Control組、si RNA組、NC組細(xì)胞進(jìn)行自噬水平發(fā)生的評(píng)估,另外通過m RFP-GFP-LC3雙熒光體系檢測(cè)自噬的發(fā)生,觀察當(dāng)Endocan基因被沉默后是否會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞明顯的自噬發(fā)生。5.Endocan基因沉默與NF-κB通路的相互影響。為了研究Endocan基因是通過怎樣的通路影響細(xì)胞存活的,在本研究選取了檢測(cè)細(xì)胞中一條重要的細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)通路NF-κB通路,因NF-κB行使基因調(diào)節(jié)功能時(shí)需進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),分別檢測(cè)細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白的量,觀察當(dāng)Endocan基因被沉默后對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)的影響,以及通過EMSA方法觀察當(dāng)Endocan基因被沉默后對(duì)NF-κB蛋白功能的影響。并進(jìn)一步進(jìn)行了用PDTC抑制NF-κB通路,檢測(cè)Endocan蛋白的表達(dá),從而觀察NF-κB通路對(duì)Endocan表達(dá)的影響。希望從基因通路上進(jìn)一步了解Endocan基因及蛋白對(duì)于細(xì)胞存活的影響�；谏鲜龅膶�(shí)驗(yàn)研究方案進(jìn)行了一系列的研究工作,在實(shí)驗(yàn)過程中得到了如下的結(jié)果:1.以肝癌細(xì)胞SH-HEP-1為研究對(duì)象,選擇沉默效果最佳的RNA干擾序列進(jìn)行Endocan基因沉默。通過MTT及Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞的增殖以及侵襲的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)Endocan基因沉默后,si RNA組增殖速度對(duì)比對(duì)照組明顯減慢,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。能夠穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)明顯少于Control組及NC組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明si RNA組細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。2.將Endocan基因沉默,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡,si RNA組細(xì)胞發(fā)生了晚期凋亡性死亡比例為15%左右,而對(duì)照組均未超過5%。另通過Western Blot及m RFP-GFP-LC3雙熒光體系檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),Endocan基因被沉默后,si RNA組發(fā)生了明顯的自噬。說明Endocan基因被沉默后誘導(dǎo)了明顯的程序性死亡。3.通過Western Blot及EMSA方法檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)、外NF-κB蛋白表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)si RNA組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB量明顯減少,功能性NF-κB明顯減少。當(dāng)抑制了NF-κB的表達(dá)后Endocan的表達(dá)也同樣被明顯抑制。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Endocan與NF-κB通路間存在相互調(diào)節(jié)作用。綜合上述的研究得出以下結(jié)論:Endocan基因沉默抑制肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲;Endocan基因沉默誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞程序性死亡;Endocan基因沉默通過與NF-κB通路的相互影響從而影響肝癌細(xì)胞SH-HEP-1的生存。
[Abstract]:In recent years , the authors have developed three RNA interference sequences and one negative control sequence . In order to study whether the endocan gene can be used as a target for the treatment of liver cancer , it can promote the growth of tumor cells . In this study , the effects of apoptosis on the expression of NF - 魏B in the control group , the si RNA group and the NC group were observed by means of the apoptosis detection kit . The effect of the expression of the endocan gene on the expression of NF - 魏B was observed .
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2062106