發(fā)布時間：2018-06-24 14:50

  本文選題：舌鱗癌細胞 + CD63-LEL��； 參考：《錦州醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的篩選與舌癌細胞總膜蛋白中與侵襲轉移相關因子CD63-LEL相互作用的蛋白質整合素β1(Integrinβ1)。采用His-pulldown技術、CO-IP技術、免疫熒光技術進一步驗證CD63-LEL與Integrinβ1在體內、體外的相互作用及在舌癌細胞內的共定位。采用體外轉染技術、實時定量PCR技術及免疫熒光技術綜合分析Integrinβ1在不同舌癌細胞株中的表達變化,初步探索Integrinβ1與CD63-LEL在舌癌細胞內的相互影響。方法1、根據人CD63的m RNA序列(NM_001780.5)設計CD63-LEL的特異性引物。提取TCA8113細胞的總RNA,采用RT-PCR擴增CD63-LEL目的基因,采用定向克隆技術插入原核表達載體p ET29a(+)中,構建重組質粒p ET29a(+)-CD63-LEL。2、采用IPTG誘導p ET29a(+)-CD63-LEL在大腸桿菌中的表達,優(yōu)化表達條件,采用His融合蛋白純化柱純化p ET29a(+)-CD63-LEL蛋白。3、常規(guī)操作方法培養(yǎng)舌鱗癌TCA8113細胞,提取TCA8113舌癌細胞總膜蛋白。采用GST-pull down方法以CD63-LEL蛋白為誘餌蛋白,調取TCA8113細胞總蛋白中能夠與CD63-LEL相互作用的蛋白質,采用不同抗體進行免疫印跡檢測,成功篩選到Integrinβ1與CD63-LEL的相互作用。4、根據人CD63的m RNA序列(NM_001780.5)及人整合素β1(gi21856332)序列,設計CD63-LEL與Integrinβ1的融合基因特異性引物,RT-PCR方法擴增目的基因,Infusion方法分別構建重組質粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1。5、采用基因體外共轉染技術將重組質粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1瞬時轉染TCA8113細胞,采用雙向CO-IP方法驗證CD63-LEL與Integrinβ1在細胞內的相互作用,熒光共聚焦顯微鏡技術觀察CD63-LEL與Integrinβ1在舌鱗癌細胞中的定位。6、培養(yǎng)TCA8113細胞株、CD63高表達TCA8113細胞株、CD63低表達TCA8113細胞株,采用實時定量PCR及Western Blot方法檢測Integrinβ1在各舌鱗癌細胞組中的表達差異,共聚焦顯微鏡觀察各組中Integrinβ1的定位。結果1、成功構建原核表達重組質粒p ET29a(+)-CD63-LEL。結果表明在37℃,IPTG濃度為0.1~1.0 mmol/L之間時,p ET29a(+)-CD63-LEL蛋白均可大量表達。IPIG濃度為1.0 mmol/L表達量最高,SDS-PAGE電泳顯示,純化蛋白大小為13.3KD,采用BCA蛋白定量試劑盒檢測,純化蛋白濃度為0.8 mg/ml。2、成功獲取TCA8113細胞中總膜蛋白,SDS-PAGE電泳顯示總膜蛋白大小位于15-170 KD之間,提取的總膜蛋白濃度為200 ug/ml。3、以純化的CD63-LEL蛋白為誘餌蛋白,與總膜蛋白雜交后進行His-pull-down檢測,采用β1、α1、PI4K等抗體檢測互做蛋白,Western Blot實驗結果顯示,CD63-LEL蛋白與總膜蛋白中Integrinβ1存在相互作用。4、真核表達載體pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1構建成功,將重組質粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、HA-Integrinβ1瞬時單轉或共轉至TCA8113細胞,48h后收集細胞,CO-IP實驗結果顯示:在15 KD、85 KD處均有條帶,與CD63-LEL、Integrinβ1大小一致,結果表明CD63-LEL蛋白與Integrinβ1在細胞內相互作用。5、重組質粒3flag-CD63-LEL、HA-Integrinβ1共轉染TCA8113細胞,采用免疫熒光技術檢測兩者在細胞內的共定位,結果顯示:CD63-LEL蛋白與Integrinβ1共定位在細胞膜及細胞質。6、培養(yǎng)TCA8113細胞株、CD63高、低表達TCA8113細胞株,48h后收集細胞,采用Real-Time PCR和Western Blot分別檢測Integrinβ1在m RNA水平及蛋白水平的表達,Real-Time PCR結果顯示CD63高表達細胞株中Integrinβ1的表達是CD63低表達細胞株的兩倍,p0.05,差異具有統計學意義,而TCA8113株與CD63低表達TCA8113株中Integrinβ1的表達幾乎無差別,p0.05,差異不具有統計學意義。免疫印跡結果表明:Integrinβ1在CD63高表達TCA8113組中的表達較TCA8113組與CD63低表達TCA8113組高。綜合分析檢測結果表明:TCA8113細胞中CD63的表達與Integrinβ1的表達呈正相關。7、共聚焦顯微鏡觀察結果顯示TCA8113細胞株、CD63高、低表達TCA8113細胞株中CD63與Integrinβ1的定位存在差異,CD63的消減沉默能夠降低Integrinβ1表達,CD63高表達TCA8113細胞中,Integrinβ1的表達相對于正常細胞明顯增高。TCA8113細胞與CD63高表達細胞株Integrinβ1定位于細胞膜與細胞質中,低表達則主要定位于細胞質中。結論1、CD63-LEL蛋白與Integrinβ1在舌癌細胞TCA8113中相互作用。2、舌鱗癌細胞株中CD63的表達量不同,Integrinβ1的表達與定位存在差異。3、TCA8113細胞中CD63的表達與Integrinβ1的表達呈正相關。
[Abstract]:Objective To screen the expression of CD63 - lel in tongue squamous cell carcinoma cell line and to extract TCA8113 cell by RT - PCR . The recombinant plasmid pcDNA A3.1 ( + ) - 3flag - CD63 - 1 was detected by Western Blot . The results showed that the expression of the recombinant plasmid pcDNA A3.1 ( + ) - 3flag - CD63 - Kl , pEFHA - 尾1was more than twice that of CD63 low expression cell line , and the results of Western Blot showed that the expression of TGF 尾 1 in the CD63 cell line was more than twice that of CD63 low expression cell line . The expression of CD63 in TCA8113 cell line was significantly higher than that in TCA8113 cell line .
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.86

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本文編號：2061887