本文選題：舌鱗癌細(xì)胞 + CD63-LEL��； 參考：《錦州醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的篩選與舌癌細(xì)胞總膜蛋白中與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子CD63-LEL相互作用的蛋白質(zhì)整合素β1(Integrinβ1)。采用His-pulldown技術(shù)、CO-IP技術(shù)、免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證CD63-LEL與Integrinβ1在體內(nèi)、體外的相互作用及在舌癌細(xì)胞內(nèi)的共定位。采用體外轉(zhuǎn)染技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)及免疫熒光技術(shù)綜合分析Integrinβ1在不同舌癌細(xì)胞株中的表達(dá)變化,初步探索Integrinβ1與CD63-LEL在舌癌細(xì)胞內(nèi)的相互影響。方法1、根據(jù)人CD63的m RNA序列(NM_001780.5)設(shè)計(jì)CD63-LEL的特異性引物。提取TCA8113細(xì)胞的總RNA,采用RT-PCR擴(kuò)增CD63-LEL目的基因,采用定向克隆技術(shù)插入原核表達(dá)載體p ET29a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET29a(+)-CD63-LEL。2、采用IPTG誘導(dǎo)p ET29a(+)-CD63-LEL在大腸桿菌中的表達(dá),優(yōu)化表達(dá)條件,采用His融合蛋白純化柱純化p ET29a(+)-CD63-LEL蛋白。3、常規(guī)操作方法培養(yǎng)舌鱗癌TCA8113細(xì)胞,提取TCA8113舌癌細(xì)胞總膜蛋白。采用GST-pull down方法以CD63-LEL蛋白為誘餌蛋白,調(diào)取TCA8113細(xì)胞總蛋白中能夠與CD63-LEL相互作用的蛋白質(zhì),采用不同抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè),成功篩選到Integrinβ1與CD63-LEL的相互作用。4、根據(jù)人CD63的m RNA序列(NM_001780.5)及人整合素β1(gi21856332)序列,設(shè)計(jì)CD63-LEL與Integrinβ1的融合基因特異性引物,RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因,Infusion方法分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1。5、采用基因體外共轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TCA8113細(xì)胞,采用雙向CO-IP方法驗(yàn)證CD63-LEL與Integrinβ1在細(xì)胞內(nèi)的相互作用,熒光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察CD63-LEL與Integrinβ1在舌鱗癌細(xì)胞中的定位。6、培養(yǎng)TCA8113細(xì)胞株、CD63高表達(dá)TCA8113細(xì)胞株、CD63低表達(dá)TCA8113細(xì)胞株,采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot方法檢測(cè)Integrinβ1在各舌鱗癌細(xì)胞組中的表達(dá)差異,共聚焦顯微鏡觀察各組中Integrinβ1的定位。結(jié)果1、成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒p ET29a(+)-CD63-LEL。結(jié)果表明在37℃,IPTG濃度為0.1~1.0 mmol/L之間時(shí),p ET29a(+)-CD63-LEL蛋白均可大量表達(dá)。IPIG濃度為1.0 mmol/L表達(dá)量最高,SDS-PAGE電泳顯示,純化蛋白大小為13.3KD,采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè),純化蛋白濃度為0.8 mg/ml。2、成功獲取TCA8113細(xì)胞中總膜蛋白,SDS-PAGE電泳顯示總膜蛋白大小位于15-170 KD之間,提取的總膜蛋白濃度為200 ug/ml。3、以純化的CD63-LEL蛋白為誘餌蛋白,與總膜蛋白雜交后進(jìn)行His-pull-down檢測(cè),采用β1、α1、PI4K等抗體檢測(cè)互做蛋白,Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CD63-LEL蛋白與總膜蛋白中Integrinβ1存在相互作用。4、真核表達(dá)載體pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1構(gòu)建成功,將重組質(zhì)粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、HA-Integrinβ1瞬時(shí)單轉(zhuǎn)或共轉(zhuǎn)至TCA8113細(xì)胞,48h后收集細(xì)胞,CO-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在15 KD、85 KD處均有條帶,與CD63-LEL、Integrinβ1大小一致,結(jié)果表明CD63-LEL蛋白與Integrinβ1在細(xì)胞內(nèi)相互作用。5、重組質(zhì)粒3flag-CD63-LEL、HA-Integrinβ1共轉(zhuǎn)染TCA8113細(xì)胞,采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)兩者在細(xì)胞內(nèi)的共定位,結(jié)果顯示:CD63-LEL蛋白與Integrinβ1共定位在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。6、培養(yǎng)TCA8113細(xì)胞株、CD63高、低表達(dá)TCA8113細(xì)胞株,48h后收集細(xì)胞,采用Real-Time PCR和Western Blot分別檢測(cè)Integrinβ1在m RNA水平及蛋白水平的表達(dá),Real-Time PCR結(jié)果顯示CD63高表達(dá)細(xì)胞株中Integrinβ1的表達(dá)是CD63低表達(dá)細(xì)胞株的兩倍,p0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而TCA8113株與CD63低表達(dá)TCA8113株中Integrinβ1的表達(dá)幾乎無(wú)差別,p0.05,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫印跡結(jié)果表明:Integrinβ1在CD63高表達(dá)TCA8113組中的表達(dá)較TCA8113組與CD63低表達(dá)TCA8113組高。綜合分析檢測(cè)結(jié)果表明:TCA8113細(xì)胞中CD63的表達(dá)與Integrinβ1的表達(dá)呈正相關(guān)。7、共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示TCA8113細(xì)胞株、CD63高、低表達(dá)TCA8113細(xì)胞株中CD63與Integrinβ1的定位存在差異,CD63的消減沉默能夠降低Integrinβ1表達(dá),CD63高表達(dá)TCA8113細(xì)胞中,Integrinβ1的表達(dá)相對(duì)于正常細(xì)胞明顯增高。TCA8113細(xì)胞與CD63高表達(dá)細(xì)胞株Integrinβ1定位于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中,低表達(dá)則主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)論1、CD63-LEL蛋白與Integrinβ1在舌癌細(xì)胞TCA8113中相互作用。2、舌鱗癌細(xì)胞株中CD63的表達(dá)量不同,Integrinβ1的表達(dá)與定位存在差異。3、TCA8113細(xì)胞中CD63的表達(dá)與Integrinβ1的表達(dá)呈正相關(guān)。
[Abstract]:Objective To screen the expression of CD63 - lel in tongue squamous cell carcinoma cell line and to extract TCA8113 cell by RT - PCR . The recombinant plasmid pcDNA A3.1 ( + ) - 3flag - CD63 - 1 was detected by Western Blot . The results showed that the expression of the recombinant plasmid pcDNA A3.1 ( + ) - 3flag - CD63 - Kl , pEFHA - 尾1was more than twice that of CD63 low expression cell line , and the results of Western Blot showed that the expression of TGF 尾 1 in the CD63 cell line was more than twice that of CD63 low expression cell line . The expression of CD63 in TCA8113 cell line was significantly higher than that in TCA8113 cell line .
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.86

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本文編號(hào)：2061887