本文選題：ATM + MAPK14��； 參考：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：自噬(autophagy)是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)自我代謝機制,通過溶酶體途徑降解受損細(xì)胞器(例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基和線粒體等)和長壽命蛋白,達(dá)到細(xì)胞內(nèi)氨基酸等原料的回收、循環(huán)再利用,從而保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞的完整性。自噬可以在多種應(yīng)激(Stress)條件下激活,如饑餓,乏氧,活性氧(reactive oxygen species,ROS)和電離輻射(ionizing radiation,IR)。自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療等過程中發(fā)揮重要作用,并且是“雙向作用”:一方面自噬在一定條件下促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活抵抗腫瘤治療;另一方面自噬也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡而增加腫瘤治療敏感性。其作用的差異主要取決于腫瘤遺傳背景或治療方案的差異。個體化和精準(zhǔn)化治療是當(dāng)前和以后腫瘤治療的趨勢,明確自噬在腫瘤治療過程中發(fā)揮的作用和機制將有利于指導(dǎo)臨床腫瘤個體化和精準(zhǔn)化治療方案的制定。共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張突變蛋白(The protein kinase ataxia-telangiectasia mutated,ATM)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,屬于PI3K家族,其磷酸化區(qū)域是疏水性[S/T]-Q。ATM主要功能是最早識別DNA雙鏈斷裂,然后磷酸化其下游靶基因進(jìn)而調(diào)控DNA損傷修復(fù),以及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等重要細(xì)胞活動。最近發(fā)現(xiàn)ATM參與調(diào)控多種遺傳毒性和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬,但是ATM在IR誘導(dǎo)自噬中的功能和機制未見報道。近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)結(jié)果發(fā)現(xiàn)電離輻射(IR)誘導(dǎo)DNA損傷后,MAPK14與ATM共享同一個磷酸化位點:TQ263。絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase14,MAPK14)屬于應(yīng)激激活蛋白激酶,是絲氨酸/蘇氨酸定向激酶,可被多種細(xì)胞外刺激激活,參與調(diào)控多種重要細(xì)胞活動,例如細(xì)胞存活,分化和細(xì)胞增殖。MAPK14對自噬具有雙重調(diào)控作用:一方面,MAPK14長期失活激活A(yù)MPK信號通路進(jìn)而激活自噬;另一方面,MAPK14可以在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)自噬相關(guān)基因的表達(dá)。然而迄今為止,ATM對MAPK14的調(diào)控關(guān)系及作用機制,尤其在IR誘導(dǎo)自噬中的作用機制未見報道。目的:本研究旨在探討ATM-MAPK14在IR誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬的作用和機制,為豐富輻射實驗?zāi)[瘤學(xué)理論并為腫瘤的基因靶向治療提供依據(jù)。方法:1選用人宮頸癌細(xì)胞株Hela和肺癌細(xì)胞株H1299為研究對象;2采用基因工程方法構(gòu)建ATM及MAPK14沉默載體,并建立相應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)的沉默細(xì)胞模型;3使用深部X射線治療機照射細(xì)胞,條件:電壓180k V,電流18.0m A,濾板0.25mm Cu和1.0mm Al,靶皮距60cm,劑量率0.40 Gy·min 1;4CCK8(cell counting Kit-8)和集落形成方法檢測細(xì)胞存活及細(xì)胞輻射敏感性;5GFP-LC3細(xì)胞模型和MDC染色檢測自噬通量(autophagy flux);6Western blot檢測蛋白表達(dá)水平變化;7免疫共沉淀(IP)檢測蛋白間相互作用;8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果:1.IR誘導(dǎo)自噬和ATM Ser1981位點的磷酸化經(jīng)過8Gy IR誘導(dǎo)Hela細(xì)胞和H1299細(xì)胞,Western blot結(jié)果顯示,MAPLC3-II/MAPLC3-I比值呈劑量依賴性(0Gy,2Gy,4Gy和8Gy)和時間依賴性(4h,8h,16h和24h)增加,其中8Gy IR后16-24h比值最高;Hela和H1299細(xì)胞構(gòu)建GFP-LC3細(xì)胞模型,8Gy IR誘導(dǎo)后,細(xì)胞中可見明顯的自噬空泡;Hela細(xì)胞和H1299細(xì)胞分別經(jīng)8Gy IR誘導(dǎo)后,MDC方法檢測自噬陽性細(xì)胞率分別從17.32%增加到54.77%和7.83%增加到25.93%。以上三種實驗結(jié)果共同提示IR誘導(dǎo)Hela細(xì)胞和H1299細(xì)胞自噬激活。同時,Western blot結(jié)果顯示:與假照組相比,ATM Ser1981位點的磷酸化在8Gy IR后30min迅速達(dá)到最高水平,4h恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。2.抑制ATM下調(diào)MAPK14表達(dá)進(jìn)而抑制MAPKAPK2磷酸化在Hela細(xì)胞和H1299細(xì)胞中構(gòu)建ATM和MAPK14沉默細(xì)胞模型。通過western blot驗證,沉默ATM后,MAPK14表達(dá)水平下調(diào),但沉默MAPK14不影響ATM表達(dá)水平。同時在H1299細(xì)胞中,沉默MAPK14明顯下調(diào)其下游靶基因MAPKAPK2表達(dá)水平。提示MAPK14很可能是ATM下游靶基因之一。另外,ATM抑制劑KU55933在抑制ATM磷酸化的同時使MAPKAPK2磷酸化水平顯著下降。提示ATM調(diào)控MAPK14-MAPKAPK2信號通路。3.抑制ATM和MAPK14增加輻射敏感性不同劑量IR處理Hela細(xì)胞和H1299細(xì)胞前2h,分別給予用ATM磷酸化抑制劑KU55933 100n M和700n M預(yù)處理,集落形成檢測細(xì)胞輻射敏感性。與DMSO對照組相比,KU55933預(yù)處理的Hela細(xì)胞和H1299細(xì)胞D0分別為3.59 vs 3.02和2.21 vs 1.59,D0值均明顯降低。Hela和H1299細(xì)胞的ATMRi和MAPK14Ri細(xì)胞模型經(jīng)過不同劑量IR處理,集落形成檢測細(xì)胞輻射敏感性。與Psuper空載體組比較,D0值分別降低(Hela-ATMRi:2.77 vs 2.13;Hela-MAPK14Ri:2.77 vs 2.19;H1299-ATMRi:2.07 vs 1.44;H1299-MAPK14Ri:2.07 vs 1.52)。以上結(jié)果提示,抑制ATM或MAPK14增加輻射敏感性,且兩者可能處在調(diào)控輻射敏感性的同一個通路。4.抑制ATM和MAPK14不影響IR誘導(dǎo)的凋亡與假照組相比,Hela和H1299沉默細(xì)胞模型經(jīng)8Gy IR處理后24h檢測通過流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡水平,空載體Psuper組、ATMRi組和MAPK14Ri組細(xì)胞中,凋亡水平均有所增加,分別為8.61%vs 12.5%、8.57%vs 14.08%、9.26%vs 13.88%和6.1%vs 10.2%,5.1%vs 11.8%,5.3%vs 9.8%,但三組之間凋亡水平的增加程度沒有差異,提示沉默ATM和MAPK14并沒有影響IR誘導(dǎo)的凋亡。5.抑制ATM和MAPK14降低Hela細(xì)胞中IR誘導(dǎo)的自噬水平首先在Hela細(xì)胞中檢測KU55933對IR誘導(dǎo)自噬的影響。經(jīng)8Gy IR處理后24h,Western blot檢測蛋白表達(dá)水平,灰度分析并計算MAPLC3II/MAPLC3I比值。DMSO對照組MAPLC3II/MAPLC3I比值呈劑量依賴性增加(0Gy:1.00,2Gy:1.46,4Gy:1.36和8Gy:1.93),而100n M KU55933提前2h預(yù)處理后各組MAPLC3II/MAPLC3I比值(0Gy:1.92,2Gy:2.05,4Gy:2.08和8Gy:1.40)無明顯增加。與DMSO組細(xì)胞比較,單獨KU55933處理使基礎(chǔ)MAPLC3比值增加(1.00 vs 1.92),但8Gy IR聯(lián)合KU55933處理使MAPKLC3比值降低(1.92vs 1.40);同時,在GFP-LC3細(xì)胞模型中,8Gy IR使DMSO對照組含自噬空泡陽性細(xì)胞率增加了124%,而經(jīng)KU55933預(yù)處理后僅增加了34.2%;另外,MDC方法檢測自噬陽性細(xì)胞率得到類似的結(jié)果(202%vs 35.72%)。三種結(jié)果共同提示KU55933抑制ATM磷酸化后,抑制Hela細(xì)胞中IR誘導(dǎo)自噬的水平。然后在Hela沉默細(xì)胞模型中進(jìn)一步驗證ATM和MAPK14的作用。8Gy IR誘導(dǎo)后24h,Western blot檢測蛋白水平變化。與假照組相比,空載體Psuper組、ATMRi組、MAPK14Ri組細(xì)胞中MAPLC3II/MAPLC3I比值分別為1.00 vs 2.71、0.75 vs 0.81和1.19 vs 0.91;同時,MDC陽性細(xì)胞率分別增加了為272%,53.18%和24.76%。以上結(jié)果表明沉默ATM和沉默MAPK14均可抑制Hela細(xì)胞中IR誘導(dǎo)的自噬水平。6.抑制ATM和MAPK14降低H1299細(xì)胞中IR誘導(dǎo)的自噬水平在H1299細(xì)胞中檢測KU55933對IR誘導(dǎo)自噬的影響。一方面,在GFP-LC3細(xì)胞模型中,8Gy IR使DMSO對照組細(xì)胞含自噬空泡陽性細(xì)胞率增加了129%,經(jīng)700n M KU55933預(yù)處理后僅增加了29.22%;另一方面,MDC染色結(jié)果顯示,8Gy IR使DMSO對照組MDC陽性細(xì)胞率增加了231%,經(jīng)700n M KU55933預(yù)處理后僅增加了24%。提示KU55933抑制ATM磷酸化后,抑制H1299細(xì)胞中IR誘導(dǎo)的自噬水平。在H1299沉默細(xì)胞模型中,8Gy IR誘導(dǎo)后24h,Western blot檢測蛋白水平變化。與假照組相比,空載體Psuper組、ATMRi組、MAPK14Ri組細(xì)胞中MAPLC3II/MAPLC3I比值分別為1.00 vs 2.07、0.91 vs 0.84和2.30 vs 0.65;另外,MDC染色結(jié)果顯示,8Gy IR使三組細(xì)胞中MDC陽性細(xì)胞率分別增加了136%,27%和-55%。表明沉默ATM抑制H1299細(xì)胞中IR誘導(dǎo)的自噬水平,雖然沉默MAPK14增加H1299的基礎(chǔ)自噬水平,但是8Gy IR誘導(dǎo)后其自噬水平下降。提示沉默ATM和沉默MAPK14均可抑制H1299細(xì)胞中IR誘導(dǎo)的自噬水平。7.抑制ATM和MAPK14減弱IR對m TOR信號通路的抑制作用與假照組相比,8Gy IR處理Hela細(xì)胞后,AKT,P-m TOR和P-P70S6K表達(dá)水平分別下降46%,59%和58%,經(jīng)100n M KU55933預(yù)處理后,各基因表達(dá)水平分別下降36%,28%和21%。Hela沉默細(xì)胞模型中,與假照組相比,8Gy IR使Psuper空載體細(xì)胞中P-P70S6K/T-P70S6K下降(1.00 vs 0.43),卻對ATMRi細(xì)胞(0.43 vs 0.34)和MAPK14Ri細(xì)胞(0.32 vs 0.33)的m TOR信號通路活性沒有影響。提示KU55933抑制ATM磷酸化,沉默ATM基因和沉默MAPK14基因可以部分解除Hela細(xì)胞中IR對m TOR信號通路活性的抑制。與假照組相比,8Gy IR處理H1299細(xì)胞后,AKT,P-m TOR和P-P70S6K表達(dá)水平分別下降50%,84%和70%,經(jīng)700n M KU55933預(yù)處理后,各基因分別下降了10%,40%和38%。H1299沉默細(xì)胞模型中,與假照組相比,8Gy IR使Psuper空載體細(xì)胞m TOR表達(dá)水平下降62%,卻沒有改變ATMRi細(xì)胞的m TOR水平。重要的是,MAPK14Ri細(xì)胞中m TOR基礎(chǔ)水平較低,為空載體對照組的0.3倍,而8Gy IR使其顯著增加至0.7倍,該變化與H1299細(xì)胞中MAPLC3的變化趨勢一致。表明KU5593抑制ATM磷酸化,沉默ATM基因和沉默MAPK14基因可以部分減弱H1299細(xì)胞中IR對m TOR信號通路的抑制作用。兩種細(xì)胞中結(jié)果共同提示ATM和MAPK14可能通過m TOR信號通路直接調(diào)控IR誘導(dǎo)的自噬。8.抑制ATM和MAPK14影響B(tài)eclin 1/PI3KIII復(fù)合物Hela細(xì)胞中,8Gy IR使空載體對照組細(xì)胞Beclin 1/PI3KIII結(jié)合增加1.63倍,而在ATMRi細(xì)胞(2.93 vs 1.36)和MAPK14Ri細(xì)胞(1.99 vs 1.09)中IR使該結(jié)合水平下降。同時,在空載體細(xì)胞中檢測到Beclin 1/ATM的結(jié)合,沉默ATM和MAPK14后該結(jié)合消失。另外,8Gy IR使空載體細(xì)胞中MAPK14/BCL2結(jié)合水平和MAPK14/Beclin1結(jié)合水平增加,而沉默ATM和MAPK14基因后兩種結(jié)合作用分別下降和不變。提示ATM和MAPK14可能通過影響B(tài)eclin 1/PI3KIII復(fù)合物參與調(diào)控IR誘導(dǎo)的自噬。H1299細(xì)胞中,8Gy IR使Beclin 1/PI3KIII結(jié)合增加29.05倍,而700n M KU55933預(yù)處理后,8Gy IR不再增加Beclin 1/PI3KIII結(jié)合。另外,在空載體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Beclin1/P-MAPKAPK2的結(jié)合,但I(xiàn)R不能改變二者結(jié)合水平。而沉默ATM后IR使該結(jié)合水平顯著下降,沉默MAPK14后二者結(jié)合消失。Beclin1/T-MAPKAPK2結(jié)合水平也發(fā)生類似變化。進(jìn)一步提示ATM和MAPK14可能通過調(diào)控Beclin 1/PI3KIII復(fù)合物增加IR誘導(dǎo)的自噬。結(jié)論:1.IR誘導(dǎo)Hela細(xì)胞和H1299細(xì)胞發(fā)生自噬及活化ATM。2.MAPK14是ATM下游底物之一。3.沉默ATM-MAPK14通路抑制IR誘導(dǎo)的自噬。4.沉默ATM-MAPK14通路減弱IR對m TOR通路的抑制作用從而降低IR誘導(dǎo)的自噬。5.沉默ATM-MAPK14通路影響B(tài)eclin1/PI3KIII復(fù)合物活性從而降低IR誘導(dǎo)的自噬。6.ATM-MAPK14通路通過m TOR信號通路和Beclin1/PI3KIII復(fù)合物調(diào)控IR誘導(dǎo)的自噬最終影響腫瘤細(xì)胞放療敏感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
，

本文編號：2060689