本文選題：miR-146a + 巨噬細胞移動抑制因子��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景神經(jīng)膠質瘤是21世紀危害人健康的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率居顱內腫瘤首位,具有遺傳不穩(wěn)定性,組織病理學表現(xiàn)多變以及不可預測的臨床行為等特點。根據(jù)世界衛(wèi)生組織基于病理結果及形態(tài)學分類描述將其分為四級,級別越高表明其惡性程度越高,高級別膠質瘤如膠質母細胞瘤等因其易向周圍腦組織浸潤生長,故單純手術切除一般難以完全治愈,常術后輔以化療、放療,基因治療,免疫治療等,但預后常較差,中位生存期較短。近年來,有關膠質瘤的早期診斷,以及發(fā)生、發(fā)展機制,分子生物學治療的靶點研究成為研究的主要目標。大量研究證實,一種新型的非編碼小RNA分子—微小RNA (miRNA)在多種腫瘤中異常表達且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及血管形成和侵襲生長密切相關,其中包括膠質瘤。miRNA是一種內源性非編碼小分子RNA(約17-20個核苷酸),它在進化過程中高度保守。通過和目標mRNA的3'-UTR靶向結合調控轉錄后蛋白表達和mRNA降解。初級miRNA (pri-miRNA)在RNA聚合酶Ⅱ作用下轉錄而來,后經(jīng)核酸酶Drosha切割成長約70個核苷酸的前體。在此之后前體miRNA通過exportin-5運輸?shù)郊毎|中,由Dicer復合物轉化為成熟miRNA。然后很快被引導進入RNA沉默復合體(RISC)復合體中,然后可和mRNA互補配對,調控mRNA的翻譯和穩(wěn)定性。其對于目標mRNA的表達的調控,無論是被降解還是蛋白翻譯抑制,這都完全取決于“種子”序列的互補性。在機體許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用,包括胚胎發(fā)育、組織生長、腫瘤發(fā)生、心律失常、缺血性心臟病、心肌肥厚、病毒性肝炎和糖尿病等。目前許多報道研究表明多種腫瘤的發(fā)生,血管生成,侵襲以及細胞凋亡等過程均和miRNA關系密切。據(jù)預測人類基因組中約有700多種miRNA,但是大多數(shù)的生物學功能仍未知。近年來關于miR-146a的研究日益引起研究者的興趣。miR-146a位于5號染色體LOC285628基因,其成熟序列在第2外顯子,其主要在先天免疫應答過程中起負調控作用,研究發(fā)現(xiàn)當微生物組分脂多糖(LPS)和細胞因子IL-1b、TNF-α刺激THP-1細胞時,成熟miR-146a的表達量即增加。另有報道示人類T細胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-I,和T淋巴細胞性白血病發(fā)生有關)、EB病毒感染和miR-146a的表達也具有相關性。其在許多炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)病機制中的作用成為目前研究的熱點,這可能和其可抑制靶點的表達有關,近期研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性疾病如類風濕性關節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和銀屑病中miR-146a的表達量也發(fā)生變化。最初關于miR-146a在腫瘤發(fā)生中的作用是由He等研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌患者的正常甲狀腺部分,其表達量明顯增高。隨后,關于兒童急性淋巴細胞白血病和急性髓系白血病,淋巴瘤,鼻咽癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展和miRNA的表達異常的關系的報道日益增多。另外,關于其在主要骨骼肌性疾病中的異常表達也相繼報道�？傊�,miR-146a在這些疾病發(fā)生發(fā)展中的作用和其靶基因IRAK1、IRAK2、TRAF6、RIG-I、IRF-5、STAT-1、PTC1等在翻譯后抑制有關。研究已經(jīng)證實,膠質瘤患者中miR-146a表達量低于正常神經(jīng)膠質組織,并且在膠質瘤細胞中的表達量也低于正常神經(jīng)膠質細胞,而且miR-146a的低表達患者往往WHO分級較高。研究表明miR-146a和膠質瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,但其具體作用機制尚不清楚。巨噬細胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF),是一種多效的炎癥介質,目前被發(fā)現(xiàn)的最早的細胞因子之一。巨噬細胞移動抑制因子(MIF)最初是從T淋巴細胞的上清液中分離提取出來,故被描述為可溶性的具有抑制巨噬細胞遷移性能的生物因子。其分子量約為12.5kDa,由115個氨基酸構成的兩個反平行α-螺旋和六個β-折疊,在內皮細胞、嗜酸性粒細胞、上皮細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等多種細胞中表達。其活性形式為三個相同亞基構成的同源三聚體,其羧基末端決定酶活性。MIF作為中間介質在多種疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,包括動脈粥樣硬化、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS).類風濕性關節(jié)炎等。作為一種促炎癥分子,MIF在TNF-α、IL-1、 PGE2和單核細胞和巨噬細胞等活化等過程中起重要作用。miR-146a和MIF兩者在膠質瘤中異常表達,我們推測MIF可能是miR-146a一個下游靶蛋白。因此,在上述基礎上,本文旨在探討miR-146a靶向調節(jié)MIF表達對膠質瘤細胞增殖的影響。本文將分三部分進行論述,分別用RT-PCR和免疫組織化學方法從基因水平和蛋白水平法檢測miR-146a和IHC和MIF在不同級別膠質瘤組織和不同細胞系中的表達情況,熒光素酶報告基因分析驗證MIF是否為miR-146a的下游靶向蛋白,并通過脂質體轉染技術將miR-146a模擬序列轉入膠質瘤細胞中,檢測MIF的表達量的變化,MTT法和平板克隆形成實驗檢測膠質瘤細胞系細胞增殖及細胞活性測定。第一部分miR-146a和MIF在膠質瘤組織中的表達及臨床意義目的探討miR-146a和MIF在膠質瘤組織中的表達及不同病理級別的相關性分析和臨床意義方法本研究收集2014年6月至2015年7月在山東大學附屬省立醫(yī)院經(jīng)手術治療和術后病理證實的膠質瘤組織和相應非腫瘤正常腦組織標本各20例。根據(jù)2007年WHO顱內腫瘤分期標準進行臨床分期。分期如下：Ⅰ-Ⅱ期14例,Ⅲ-Ⅳ期6例。其中男性患者9例,女性患者11例,年齡31-56歲,每份標本分成兩份,一份行RT-PCR檢測,另一份行免疫組織化學檢測MIF表達。結果1、RT-PCR結果顯示miR-146a在癌旁正常腦組織和膠質瘤組織中均表達,且在腦膠質瘤組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織,比值為(0.68±0.05)vs(0.23±0.00),差異顯著(p0.05),且隨著腫瘤WHO級別的增高,其表達量降低；2、RT-PCR結果顯示MIF mRNA在癌旁正常腦組織和膠質瘤組織中均表達,且在腦膠質瘤組織中的表達水平顯著高于癌旁正常腦組織；3、免疫組化結果顯示,MIF在膠質瘤組織中的表達顯著高于癌旁正常組織(0.89±0.02)vs.(5.49±0.48),(p0.01),且隨著腫瘤惡性程度增加,其表達量亦增加;4、RT-PCR結果示當miR-146a的表達量增加時,MIF mRNA的表達量隨之降低,反之,當miR-146a的表達量較低時,MIF mRNA的表達量增高。結論1、miR-146a和MIF在癌旁正常腦組織和膠質瘤組織中均表達,但在膠質瘤組織中miR-146a表達下調,MIF表達上調；2、MIF主要分布于細胞質中,且在癌旁正常腦組織和膠質瘤組織中均表達；3、miR-146a和MIF在膠質瘤中表達和膠質瘤惡性程度相關。第二部分miR-146a過表達對神經(jīng)膠質瘤細胞侵襲增殖的影響目的探討過表達miR-146a對神經(jīng)膠質瘤細胞生長的影響方法體外培養(yǎng)U251,U87,C6三種膠質瘤細胞系以及正常星形膠質細胞(RA),分別對其進行Q-PCR檢測miR-146a的表達情況。根據(jù)三種細胞系miR-146a的表達,選擇U87細胞系繼續(xù)進行研究,將其分成兩組,分別為轉染miR-146a模擬物組(miR-146a mimic組),miR-146a陰性對照組(negative control, NC組)。MTT法和平板克隆形成實驗檢測miR-146a對膠質瘤細胞系U87增殖活力作用的影響。結果1、實時定量PCR檢測結果表明,在膠質母細胞瘤細胞系U251,U87和C6中miR-146a的表達均明顯低于正常星形膠質細胞(RA),(0.20 ± 0.02,0.24 ± 0.04, 0.51 ± 0.05,0.52 ± 0.02) vs(0.75 ± 0.02),差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)；2、MTT實驗結果示,U87細胞轉染miR-146a模擬物后,miR-146a mimic組細胞活力與NC組相比明顯降低(P=0.0074)；3、平板克隆形成實驗結果示miR-146a mimic組細胞相比NC組集落形成能力明顯下降(68.34士8.23)vs(35.49士3.65),(P=0.00032)。結論1、miR-146a在正常星形膠質細胞和三種膠質瘤細胞系中均表達,但在三種膠質瘤細胞系中表達下調,且在U87細胞系中表達適中；2、miR-146a上調可降低膠質瘤細胞增殖活性；第三部分miR-146a靶向調控MIF對神經(jīng)膠質瘤細胞的作用機制目的探討miR-146a靶向調控MIF對神經(jīng)膠質瘤細胞的作用機制方法miR-146a模擬物(miR-146a mimic), MiR-146a陰性對照(NC),野生型載體pGL3-MIF 3'UTR-Wt和突變型載體pGL3-MIF 3'UTR-Mut均轉染至U87細胞中,分組如下：miR-146a mimics + Wt MIF, miR-146a mimics NC + Wt MIF, miR-146a mimics + Mut MIF, miR-146a mimics NC + Mut MIF。采用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測轉染的熒光素酶活性以及miR-146a和MIF 3'UTR基因的靶向關系。RT-PCR和Western blot分別檢測U87細胞轉染miR-146a mimic和NC后,MIF mRNA和蛋白表達水平的變化。結果1、miR-146a mimics + pGL3-MIF 3'UTR-Wt共轉染組的熒光信號強度明顯弱于其他轉染組,差異有顯著性(p0.01)。然而,對于突變型載體pGL3-MIF 3'UTR-Mut,不同組的熒光強度沒有明顯區(qū)別(p0.05)；2、RT-PCR和Westerm blot結果示miR-146a模擬物轉染U87細胞后,MIF蛋白和mRNA的表達量下調(P=0.0045,P=0.0041)。結論miR-146a可與MIF基因3'UTR靶向結合,控制MIF基因的轉錄后翻譯,提供了MIF轉錄后翻譯的機制理論,可能為膠質瘤的治療提供新的靶點。
[Abstract]:A new type of non - coding small RNA molecule - micro RNA ( miRNA ) , which is a kind of endogenous non - coding small molecule RNA ( about 17 - 20 nucleotides ) , is highly conserved in the course of evolution . It has been found that the expression of miR - 14s in human glioma is lower than that of normal neuroglia , and that the expression of miR - 14is lower than that of normal neuroglia . In conclusion , it is shown that the expression of miR - 14is lower than that of normal neuroglia . In this study , we collected 20 cases of glioma tissues and corresponding non - tumor normal brain tissues from June 2014 to July 2015 . The results showed that the expression levels of miR - 14and MIF in the tissues of glioma were significantly lower than those in normal tissues ( 0 . 68 鹵 0 . 05 ) vs ( 0.23 鹵 0.00 ) .
2 . RT - PCR showed that MIF mRNA was expressed in normal brain tissues and glioma tissues , and the level of MIF mRNA was significantly higher in glioma tissues than in normal brain tissues .
3 . Immunohistochemical results showed that MIF mRNA expression was significantly higher in glioma tissues than in normal tissues ( 0.89 鹵 0.02 ) vs . ( 5.49 鹵 0.48 ) , ( P 0.01 ) .
2 . MIF was mainly distributed in cytoplasm and was expressed in normal brain tissues and glioma tissues .
3 銆，

本文編號：2048535