本文選題：miRNA + Gefitinib　； 參考：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：目的:以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)為代表的分子靶向藥物用于臨床,治療EGFR驅(qū)動(dòng)突變的晚期非小細(xì)胞肺癌取得了驚人的療效,但患者在中位9-13個(gè)月后,終將發(fā)生獲得性耐藥。EGFR基因20號(hào)外顯子T790M突變是最主要的耐藥機(jī)制,以O(shè)simertinib為代表的第三代EGFR-TKIs已進(jìn)入臨床應(yīng)用,使患者生存進(jìn)一步延長。但其他的耐藥機(jī)制尚無更好的辦法去克服,亟待尋求新的研究途徑。有證據(jù)顯示miRNA與腫瘤的耐藥性相關(guān),本課題旨在篩選Gefitinib耐藥相關(guān)的miRNA,并探索相關(guān)miRNA在人肺腺癌細(xì)胞株與耐藥相關(guān)基因相互調(diào)控的機(jī)制。方法:PC9細(xì)胞采用逐步遞增Gefitinib藥物濃度、間歇作用體外誘導(dǎo)獲得耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR,同時(shí)納入人肺腺癌A549和H1975細(xì)胞株,MTT試驗(yàn)計(jì)算4株細(xì)胞對(duì)Gefitinib的半數(shù)抑制率(IC50),通過直接測序法獲得4株細(xì)胞EGFR基因19～21外顯子突變譜;利用基因芯片檢測PC9與PC9/GR之間miRNA的差異表達(dá)譜,篩選出最終待研究miRNA;聯(lián)合應(yīng)用TargetScans, miRanda, PicTar及FindTar等生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫,預(yù)測miRNA的靶基因;構(gòu)建miRNA過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞株,MTT試驗(yàn)及流式細(xì)胞檢測細(xì)胞耐藥變化及存活率;RT-PCR和Western Blot驗(yàn)證靶基因和蛋白表達(dá)變化;siRNA沉默PC9靶基因,MTT及流式細(xì)胞進(jìn)一步檢測PC9細(xì)胞對(duì)Gefitinib敏感性的變化;雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測待研究miRNA與靶基因的關(guān)系。結(jié)果:經(jīng)藥物誘導(dǎo)獲得耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR,對(duì)Gefitinib IC50可達(dá)26.599μmol/L,本株 PC9 1.187μmol/L, A549 16.648μmol/L, H1975 9.002μmol/L;芯片檢測 PC9 與PC9/GR miRNA差異表達(dá)譜,獲得78個(gè)在PC9/GR中上調(diào)2倍,129個(gè)下調(diào)1/2的miRNAs;其中miR-221-3p在PC9/GR中上調(diào)2.45倍,并且RT-PCR驗(yàn)證miR-221-3p的表達(dá)水平在兩株細(xì)胞有顯著差異,p=0.0002。直接測序顯示PC9細(xì)胞EGFR19 外顯子 del E746-749, PC9/GR EGFR19 外顯子 delE746-749, A549 EGFR 19～21全野生型,H1975 EGFR 20外顯子T790M合并21 L858R。構(gòu)建miR-221表達(dá)上調(diào)PC9細(xì)胞,構(gòu)建miR-221表達(dá)下調(diào)PC9/GR,A549和H1975, MTT檢測PC9細(xì)胞耐藥性增加,IC50提高了 4倍,PC9/GR和H1975耐藥性逆轉(zhuǎn),IC50分別降低了 2.6倍和2.97倍,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異,而A549無顯著變化。流式細(xì)胞檢測過表達(dá)miR-221-3p PC9細(xì)胞在Gefitinib作用下凋亡率減少,而低表達(dá)miR-221-3p PC9/GR和H1975凋亡比例增加,A549凋亡比例變化不大。Targetscan等數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-221-3p下游靶基因可能是CDKN1B/p27, DKK2和PTEN,在miR-221表達(dá)上調(diào)的A549細(xì)胞中3條預(yù)測靶基因表達(dá)水平與本株比較無改變(p=0.076 for DKK2,p=0.2519 for PTEN, p=0.6121 for CDKN1B/p27),而構(gòu)建 miR-221 表達(dá)抑下調(diào)的PC9/GR和H1975細(xì)胞與本株相比,靶基因產(chǎn)生表達(dá)水平的顯著升高。WB蛋白水平驗(yàn)證進(jìn)一步證實(shí)A549細(xì)胞CDKN1B/p27, DKK2和PTEN 3條蛋白含量在改變miR-221表達(dá)前后無顯著變化。而PC9和PC9/GR細(xì)胞中CDKN1B/p27蛋白含量在改變miR-221表達(dá)前后無顯著變化,但DKK2和PTEN蛋白含量有顯著變化。H1975細(xì)胞的3條蛋白含量均有顯著變化(p=0.0183 for CDKN1B/p27,p=0.0074 for PTEN,p=0.0165 for DKK2)。siRNA沉默PC9 3條靶基因,MTT及流式細(xì)胞顯示在沉默PTEN 和DKK2 后 PC9 獲得對(duì)Gefitinib 的耐藥性(IC50 siPTEN 2.98 倍,siDKK2 3.35倍),而沉默CDKN1B/p27后藥敏無顯著改變。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)顯示PTEN和DKK2基因是miR-221 -3p的下游靶基因。結(jié)論:miR-221-3p在肺癌耐Gefitinib細(xì)胞株P(guān)C9/GR高表達(dá),PTEN、DKK2為miR-221-3p的靶基因,miR-221-3p通過下調(diào)PTEN和DKK2,誘導(dǎo)EGFR 19外顯子或21外顯子突變型細(xì)胞發(fā)生耐藥。
[Abstract]:Objective : To investigate the relationship between the expression of EGFR gene and target gene in human lung adenocarcinoma cell line ( PC9 / GR ) . The expression level of CDKN1B / p27 , DKK2 and PTEN in A549 cells was significantly lower than that in A549 cells ( p = 0.076 for DKK2 , p = 0.2519 for PTEN , p = 0.6121 for CDKN1B / p27 ) . Conclusion : The expression of PTEN and DKK2 gene is the target gene of miR - 221 - 3P . Conclusion : The expression of PTEN and DKK2 is the target gene of miR - 221 - 3P . Conclusion : The expression of PTEN and DKK2 is the target gene of miR - 221 - 3P . Conclusion : miR - 221 - 3P can induce the resistance of EGFR 19 exon or 21 exon mutant cells by downregulating PTEN and DKK2 .
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2048240