本文選題：NPM1 + 基因突變�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一組臨床上細胞遺傳學和分子生物學具有高度異質(zhì)性的惡性血液病。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)基因突變是AML最常見的一種基因突變。已有的文獻報道NPM1基因突變是白血病發(fā)生的始動因素。然而,NPM1突變基因促進AML惡性轉(zhuǎn)化的分子機制仍尚未完全闡明。自噬是真核細胞中比較保守的一種代謝途徑,通過溶酶體途徑降解胞內(nèi)折疊錯誤的蛋白質(zhì)或受損的細胞器以維持細胞穩(wěn)態(tài)。越來越多的證據(jù)表明自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療療效密切相關(guān)。此外,最新臨床研究顯示,NPM1突變陽性AML樣本中存在腫瘤抑制因子早幼粒細胞白血病蛋白PML異常的亞細胞定位。本文主要探討NPM1基因突變對白血病細胞自噬的調(diào)控作用,進一步觀察自噬水平的改變對NPM1突變白血病細胞體外增殖的影響,并初步探討異常表達的PML蛋白在NPM1突變介導的白血病細胞自噬中的作用。方法:首先采用過表達和慢病毒介導的RNA干擾方法,觀察A型NPM1基因突變(NPM1-mA)對白血病細胞自噬水平的調(diào)控作用,進一步觀察自噬誘導劑rapamycin或抑制劑3-methyladenine(3-ma)處理對npm1-ma介導的細胞體外增殖能力的影響。qrt-pcr和westernblot檢測髓系白血病細胞株和臨床aml樣本中pml的表達水平;免疫組化和免疫熒光檢測pml蛋白在髓系白血病細胞中的分布情況。免疫共沉淀檢測npm1突變蛋白與pml蛋白之間的相互作用。過表達或者干擾npm1-ma后觀察pml蛋白水平的變化。cycloheximide和mg132處理進一步觀察npm1-ma對pml蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控。接下來,利用慢病毒介導的rna干擾技術(shù)下調(diào)pml水平,探討干擾pml對天然攜帶npm1突變基因的oci-aml3白血病細胞株的自噬、體外增殖能力以及akt信號分子的改變。最后,通過rescue實驗觀察過表達pml對npm1-maknockdown的oci-aml3細胞株自噬和體外增殖能力的影響。結(jié)果:首先,過表達npm1-ma能夠增強thp-1白血病細胞株自噬水平,3-ma處理能夠減弱npm1-ma介導的細胞體外增殖能力;相反,干擾npm1-ma則抑制oci-aml3細胞自噬水平,而rapamycin處理能逆轉(zhuǎn)npm1-maknockdown介導的細胞體外增殖能力。其次,在npm1-ma陽性的aml樣本和oci-aml3細胞株中證實了pml的表達和蛋白的異常胞質(zhì)定位。免疫共沉淀驗證了npm1-ma蛋白與pml蛋白的相互作用。此外,過表達npm1-ma能上調(diào)pml蛋白表達水平,干擾npm1-ma則下調(diào)pml蛋白表達水平。cycloheximide和mg132處理進一步驗證了npm1突變蛋白是通過抑制蛋白酶體途徑來增強pml蛋白的穩(wěn)定性。接著,干擾pml導致oci-aml3體外增殖能力和克隆形成能力減弱。另外,干擾PML可抑制細胞自噬活性進而影響細胞增殖能力,這可能與AKT信號分子的改變有關(guān)。最后,rescue實驗表明,過表達PML能夠逆轉(zhuǎn)NPM1-mA下調(diào)對白血病細胞自噬和增殖能力的抑制作用。結(jié)論:NPM1突變蛋白可促進白血病細胞的自噬和增殖能力。機制上,NPM1-mA與PML蛋白相互作用介導PML的異常胞質(zhì)定位及穩(wěn)定性;PML可能通過AKT信號分子調(diào)控白血病細胞的自噬活性,進而增強NPM1突變白血病細胞的體外增殖能力。本研究提示抑制自噬或者靶向PML蛋白可作為臨床上治療NPM1突變白血病的一種新策略。
[Abstract]:Objective: acute myeloid leukemia (AML) is a group of malignant hematopathy with high heterogeneity in clinical cytogenetics and molecular biology. The mutation of nucleolar phosphoric acid (nucleophosmin, NPM1) gene is the most common gene mutation in AML. It has been reported that the mutation of NPM1 gene is the beginning of the occurrence of leukemia. Factors. However, the molecular mechanism of NPM1 mutation to promote the malignant transformation of AML is still not fully elucidated. Autophagy is a relatively conservative metabolic pathway in eukaryotic cells to degrade wrong proteins or damaged organelles through the lysosome pathway to maintain cell homeostasis. The more evidences indicate the occurrence of autophagy and the occurrence of tumors Development and therapeutic efficacy are closely related. In addition, the latest clinical study shows that the subcellular localization of the tumor suppressor promyelocytic leukemia protein PML abnormality exists in the NPM1 mutation positive AML sample. This paper mainly discusses the regulation of NPM1 mutation on autophagy in leukemic cells and further observation of the change of autophagy to NPM1 mutation The effect of the proliferation of leukemic cells in vitro, and the role of abnormal expression of PML protein in autophagy mediated by NPM1 mutation in leukemia cells. Methods: first, using overexpression and lentivirus mediated RNA interference to observe the regulation of A NPM1 gene mutation (NPM1-mA) on the autophagy level of leukemic cells and further observe autophagy. Effects of inducer rapamycin or inhibitor 3-methyladenine (3-mA) treatment on the proliferation of npm1-ma mediated cells in vitro:.Qrt-pcr and Westernblot detection of PML expression in myeloid leukemia cell lines and clinical AML samples; immunohistochemical and immunofluorescence detection of the distribution of PML protein in myeloid leukemia cells. Immunofulcation Interaction between NPM1 mutant protein and PML protein. Over expression or disturbance of npm1-ma after npm1-ma observation of PML protein level change.Cycloheximide and MG132 treatment further observe the regulation of PML protein stability by npm1-ma. Next, use the lentivirus mediated RNA interference technique to adjust PML level, explore the interference PML on the natural carrying NPM Autophagy, in vitro proliferation ability and changes in Akt signal molecules of the 1 mutant gene oci-aml3 leukemia cells. Finally, the effects of PML on the autophagy and in vitro proliferation of npm1-maknockdown oci-aml3 cell lines were observed by rescue experiments. Results: first, overexpression of npm1-ma could enhance the autophagy level of THP-1 leukemia cell lines, 3 -ma treatment could weaken the proliferation ability of npm1-ma mediated cells in vitro; on the contrary, interference with npm1-ma inhibited the autophagy level of oci-aml3 cells, and rapamycin treatment could reverse the proliferation ability of npm1-maknockdown mediated cells in vitro. Secondly, the expression of PML and the abnormal cytoplasm of the protein were confirmed in the npm1-ma positive AML samples and oci-aml3 cell lines. The interaction between npm1-ma protein and PML protein was confirmed by immunoprecipitation. In addition, overexpression of npm1-ma could increase the expression of PML protein, interfering npm1-ma and decreasing PML protein expression level.Cycloheximide and MG132 treatment further verified that NPM1 mutation protein enhanced the stability of PML protein by inhibiting the egg white enzyme body pathway. In addition, interfering with PML in vitro proliferation and clonogenic ability of oci-aml3 decreased. In addition, interfering PML could inhibit cell autophagy and affect cell proliferation, which may be related to the change of AKT signal molecules. Finally, rescue experiment showed that overexpression of PML could reverse the inhibition of autophagy and proliferation of leukemic cells by NPM1-mA down regulation. Conclusion: NPM1 mutant protein can promote the autophagy and proliferation of leukemia cells. The interaction of NPM1-mA and PML protein mediates the abnormal cytoplasmic localization and stability of PML; PML may regulate the autophagy activity of leukemic cells through AKT signal molecules, and then enhance the proliferation ability of NPM1 mutant leukemia cells in vitro. These findings suggest that inhibition of autophagy or targeting of PML protein can be used as a new strategy for clinical treatment of NPM1 mutant leukemia.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.71

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本文編號：2046115