本文選題：大腸癌 + lncRNAs��； 參考：《上海交通大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分lnc RNA組合與大腸癌病人預后的相關研究目的:結直腸癌(colorectal cancer,CRC)中具有預測價值的編碼蛋白基因(protein coding gene,PCG)報道很多,卻僅有很少能實際運用于臨床,因此尋找有實用價值的分子標志物顯得尤為迫切。越來越多的證據(jù)顯示長鏈非編碼(long non coding,lnc)RNAs在癌癥中表達異常,然而目前l(fā)nc RNAs用于預測大腸癌病人的預后尚無報道,對lnc RNAs的研究也許能為CRC分子靶標的尋找?guī)硪恍﹩⑹�。本課題擬篩選并建立一個lnc RNA組合,旨在探討其對大腸癌病人預后的預測價值。方法:從GEO數(shù)據(jù)庫下載CRC基因表達譜資料:GSE39582檢測集(N=436),GSE39582內(nèi)部驗證集(N=117);GSE14333(N=197)和GSE17536(N=145),通過重新注釋探針獲取lnc RNA表達數(shù)據(jù)。在GSE39582檢測集數(shù)據(jù)中,通過BRB tool array和多因素Cox回歸方法篩選出一個lnc RNAs組合,基于這個lnc RNAs組合建立危險評分公式,并以危險分數(shù)中位數(shù)為分割將GSE39582檢測集病人分成高風險組和低風險組,驗證其預測GSE39582檢測集中病人的無病生存期(disease free survival,DFS)的準確性。在GSE39582內(nèi)部驗證集和2個獨立的CRC數(shù)據(jù)中進一步檢驗該lnc RNAs組合對CRC病人預后的預測能力。基因富集分析(Gene score enrichment analysis,GSEA)lnc RNAs組合與癌癥的哪些通路相關。在CRC細胞系HCT116和SW1116中分別轉染3條lnc RNAs,AK123657、BX648207和BX649059 si RNAs,CCK8和Transwell實驗檢測3條lnc RNAs分別敲低后對CRC細胞功能的影響。結果:我們篩選出一個六條lnc RNAs組合,建立風險公式:Risk score=(0.07826*AK024680)+(-0.14300*AK123567)+(-0.19355*CR622106)+(-0.00172*BX649059)+(-0.20855*BX648207)+(0.24326*AK026784)。Ln RNAs組合與GSE39582檢測集CRC病人DFS相關。基于Risk score(RS)中位數(shù),GSE39582檢測集病人可以分為高風險組和低風險組(HR=2.670;P0.0001)。該lnc RNAs組合對CRC病人預后的預測能力在GSE39582內(nèi)部驗證集(N=117)和2個獨立的CRC數(shù)據(jù)(GSE14333,N=197和GSE17536,N=145))中得到驗證。GSEA分析結果提示lnc RNAs組合與多種癌癥的轉移通路相關。體外功能實驗表明其中三條lnc RNAs,AK123657、BX648207和BX649059與CRC細胞侵襲和增殖抑制有關。結論:Lnc RNAs可能成為CRC臨床預后一項有效的預測工具。第二部分Lnc RNA-GAPLINC促進GC發(fā)生發(fā)展的作用及其機制研究目的:越來越多的證據(jù)顯示lnc RNAs與PCGs一樣具備促癌或抑癌功能,lnc RNAs很可能成為一類新的癌癥標志物和治療靶標。本研究擬通過高通量芯片(microarray)篩選胃癌中異常表達的lnc RNAs,并且探討其作為胃癌標志物對胃癌病人臨床特征及生存期的預測能力,以及深入探討其可能影響胃癌發(fā)生發(fā)展的功能與調(diào)控機制。方法:利用lnc RNA Arraystar基因芯片檢測10對胃癌和對應癌旁正常組織中l(wèi)nc RNAs和m RNAs的表達情況。探討異常表達的lnc RNAs是否與基因組拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)和轉錄因子激活有關,并通過實時定量(real-time quantative,RT-q)PCR和染色質免疫共沉淀實驗(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)驗證預測結果。我們利用“縮小重心法”分別建立一個lnc RNAs和m RNAs表達公式用于區(qū)分胃癌或正常胃黏膜組織,并對比lnc RNs和m RNAs組合區(qū)分癌癥和正常組織的準確性。選取最有預測價值的lnc RNA,在90例胃癌病人的癌組織和癌旁正常組織標本采用原位雜交技術(in situ hybridyzation,ISH)檢測該lnc RNA的表達情況,并分析其與各臨床特征之間的相關性。將胃癌細胞系MGC803轉染lnc RNA si RNAs和對照si RNAs后,采用表達譜芯片Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 microarrays(三次重復;GEO#GSE51651)篩選lnc RNA下游通路和靶基因。通過si RNAs干擾和轉染質粒的方式檢測敲低和升高lnc RNA后對胃癌MGC803和SGC7901細胞凋亡、增殖、侵襲等功能的影響,以及對“細胞遷移通路”中主要蛋白CD44的RNA和蛋白水平的影響。通過多步實驗結果初步設想lnc RNA結合micro RNA(mi RNA)發(fā)揮其對下游基因的調(diào)控。采用生物信息學方法預測mi RNA與lnc RNA和CD44發(fā)生相互作用的位點,構建lnc RNA和CD44 3’UTR的熒光素酶報告基因,明確mi RNA結合lnc RNA和CD44的結構域。觀察lnc RNA對裸鼠皮下移植瘤生長的影響,實驗組注射穩(wěn)定敲低lnc RNA的MGC803細胞系,對照組注射穩(wěn)定表達空白載體的MGC803細胞系,并分離瘤體檢測lnc RNA、mi RNA及CD44在兩組中的表達差異。結果:Lnc RNAs在胃癌中的異常表達與拷CNV和轉錄激活有關。P53突變體R282W對lnc RNA-uc002kmd.存在轉錄激活作用。Lnc RNAs用于區(qū)分胃癌和正常黏膜組織的能力與m RNAs的相當(兩者最低錯誤率都為0.196)。建立的lnc RNAs預測組合包括九條lnc RNAs,差異表達最大的是uc002kmd.1,其在胃癌組織中的表達水平明顯高于相應的癌旁正常胃黏膜組織。48對胃癌和癌旁正常組織中運用RT-q PCR技術檢測uc002kmd.1的表達量,胃癌組織中其表達量顯著增高。ROC曲線評價uc002kmd.1預測胃癌組織的敏感性和特異性很高,曲線下面積(area under curve,AUC)為0.714�？紤]到uc002kmd.1預測胃癌的能力,我們將其命名為GAPLINC(Gastric Adenocarcinoma Predictive Long Intergenic Non-Coding RNA)。GAPLINC的表達水平與胃癌病人腫瘤體積、遠處轉移、腫瘤累及3/5淋巴結組比率以及臨床分級等因素呈明顯正相關(P0.01)。GAPLINC高表達可顯著降低胃癌細胞凋亡、促進增殖和侵襲能力。通過表達譜芯片篩選和GSEA分析,GAPLINC下游基因中相當一部分與“細胞轉移通路”密切相關,GAPLINC的表達水平與CD44具有強相關性;GAPLINC發(fā)揮原癌基因功能部分依賴于CD44;裸鼠試驗中體內(nèi)敲低GAPLINC可明顯抑制移植瘤生長,GALINC穩(wěn)定敲低組標本中GAPLINC及CD44水平均低于對照組;熒光素酶報告實驗提示GAPLINC通過與CD44競爭結合mi R-211-3p,從而影響CD44的表達水平。結論:本研究提示CNV和轉錄活化影響胃癌中l(wèi)nc RNAs的表達。GAPLINC可作為影響胃癌發(fā)生發(fā)展的重要因子,在體內(nèi)組織學水平和體外細胞學水平調(diào)控胃癌增殖、侵襲、轉移等情況,從而影響胃癌患者的預后,且其功能的發(fā)揮部分依賴于CD44;GAPLINC通過與CD44競爭結合mi R-211-3p發(fā)揮對CD44的調(diào)控作用。
[Abstract]:In GSE39582 , we screened and established an lnc RNA composition for predicting the prognosis of patients with colorectal cancer . Risk score = ( 0.07826 * AKE24680 ) + ( - 0.14300 * AK123567 ) + ( - 0.19355 * CR22106 ) + ( - 0.19355 * CR22106 ) + ( - 0.20855 * B29649059 ) + ( - 0.20855 * ) . Ln RNAs combination was related to the GSE39582 detection set CRC patient DFS . Based on the median of Risk score ( RS ) , GSE39582 test set patients could be classified into high - risk groups and low - risk groups ( HR = 2.670 ; P0.0001 ) . In this study , the expression of lnc RNAs and mRNA in normal tissues of gastric cancer and normal tissues of gastric cancer were studied by means of high throughput chip ( RT - q ) PCR and chromatin immunocodeposition ( Ch IP ) . The expression level of lnc RNA and CD44 in gastric cancer was significantly higher than that of normal gastric mucosa . The expression level of lnc RNA and CD44 in gastric cancer was significantly higher than that of normal gastric mucosa . GAPLINC plays an important role in the development of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in inhibiting the proliferation , invasion and metastasis of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in inhibiting the growth of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in inhibiting the growth of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in the prognosis of gastric cancer patients .
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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本文編號：2038078