本文選題：大腸癌 + lncRNAs　； 參考：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分lnc RNA組合與大腸癌病人預(yù)后的相關(guān)研究目的:結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)中具有預(yù)測(cè)價(jià)值的編碼蛋白基因(protein coding gene,PCG)報(bào)道很多,卻僅有很少能實(shí)際運(yùn)用于臨床,因此尋找有實(shí)用價(jià)值的分子標(biāo)志物顯得尤為迫切。越來(lái)越多的證據(jù)顯示長(zhǎng)鏈非編碼(long non coding,lnc)RNAs在癌癥中表達(dá)異常,然而目前l(fā)nc RNAs用于預(yù)測(cè)大腸癌病人的預(yù)后尚無(wú)報(bào)道,對(duì)lnc RNAs的研究也許能為CRC分子靶標(biāo)的尋找?guī)?lái)一些啟示。本課題擬篩選并建立一個(gè)lnc RNA組合,旨在探討其對(duì)大腸癌病人預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法:從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載CRC基因表達(dá)譜資料:GSE39582檢測(cè)集(N=436),GSE39582內(nèi)部驗(yàn)證集(N=117);GSE14333(N=197)和GSE17536(N=145),通過(guò)重新注釋探針獲取lnc RNA表達(dá)數(shù)據(jù)。在GSE39582檢測(cè)集數(shù)據(jù)中,通過(guò)BRB tool array和多因素Cox回歸方法篩選出一個(gè)lnc RNAs組合,基于這個(gè)lnc RNAs組合建立危險(xiǎn)評(píng)分公式,并以危險(xiǎn)分?jǐn)?shù)中位數(shù)為分割將GSE39582檢測(cè)集病人分成高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組,驗(yàn)證其預(yù)測(cè)GSE39582檢測(cè)集中病人的無(wú)病生存期(disease free survival,DFS)的準(zhǔn)確性。在GSE39582內(nèi)部驗(yàn)證集和2個(gè)獨(dú)立的CRC數(shù)據(jù)中進(jìn)一步檢驗(yàn)該lnc RNAs組合對(duì)CRC病人預(yù)后的預(yù)測(cè)能力�；蚋患治�(Gene score enrichment analysis,GSEA)lnc RNAs組合與癌癥的哪些通路相關(guān)。在CRC細(xì)胞系HCT116和SW1116中分別轉(zhuǎn)染3條lnc RNAs,AK123657、BX648207和BX649059 si RNAs,CCK8和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3條lnc RNAs分別敲低后對(duì)CRC細(xì)胞功能的影響。結(jié)果:我們篩選出一個(gè)六條lnc RNAs組合,建立風(fēng)險(xiǎn)公式:Risk score=(0.07826*AK024680)+(-0.14300*AK123567)+(-0.19355*CR622106)+(-0.00172*BX649059)+(-0.20855*BX648207)+(0.24326*AK026784)。Ln RNAs組合與GSE39582檢測(cè)集CRC病人DFS相關(guān)�；赗isk score(RS)中位數(shù),GSE39582檢測(cè)集病人可以分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組(HR=2.670;P0.0001)。該lnc RNAs組合對(duì)CRC病人預(yù)后的預(yù)測(cè)能力在GSE39582內(nèi)部驗(yàn)證集(N=117)和2個(gè)獨(dú)立的CRC數(shù)據(jù)(GSE14333,N=197和GSE17536,N=145))中得到驗(yàn)證。GSEA分析結(jié)果提示lnc RNAs組合與多種癌癥的轉(zhuǎn)移通路相關(guān)。體外功能實(shí)驗(yàn)表明其中三條lnc RNAs,AK123657、BX648207和BX649059與CRC細(xì)胞侵襲和增殖抑制有關(guān)。結(jié)論:Lnc RNAs可能成為CRC臨床預(yù)后一項(xiàng)有效的預(yù)測(cè)工具。第二部分Lnc RNA-GAPLINC促進(jìn)GC發(fā)生發(fā)展的作用及其機(jī)制研究目的:越來(lái)越多的證據(jù)顯示lnc RNAs與PCGs一樣具備促癌或抑癌功能,lnc RNAs很可能成為一類新的癌癥標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。本研究擬通過(guò)高通量芯片(microarray)篩選胃癌中異常表達(dá)的lnc RNAs,并且探討其作為胃癌標(biāo)志物對(duì)胃癌病人臨床特征及生存期的預(yù)測(cè)能力,以及深入探討其可能影響胃癌發(fā)生發(fā)展的功能與調(diào)控機(jī)制。方法:利用lnc RNA Arraystar基因芯片檢測(cè)10對(duì)胃癌和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中l(wèi)nc RNAs和m RNAs的表達(dá)情況。探討異常表達(dá)的lnc RNAs是否與基因組拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)和轉(zhuǎn)錄因子激活有關(guān),并通過(guò)實(shí)時(shí)定量(real-time quantative,RT-q)PCR和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。我們利用“縮小重心法”分別建立一個(gè)lnc RNAs和m RNAs表達(dá)公式用于區(qū)分胃癌或正常胃黏膜組織,并對(duì)比lnc RNs和m RNAs組合區(qū)分癌癥和正常組織的準(zhǔn)確性。選取最有預(yù)測(cè)價(jià)值的lnc RNA,在90例胃癌病人的癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本采用原位雜交技術(shù)(in situ hybridyzation,ISH)檢測(cè)該lnc RNA的表達(dá)情況,并分析其與各臨床特征之間的相關(guān)性。將胃癌細(xì)胞系MGC803轉(zhuǎn)染lnc RNA si RNAs和對(duì)照si RNAs后,采用表達(dá)譜芯片Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 microarrays(三次重復(fù);GEO#GSE51651)篩選lnc RNA下游通路和靶基因。通過(guò)si RNAs干擾和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方式檢測(cè)敲低和升高lnc RNA后對(duì)胃癌MGC803和SGC7901細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲等功能的影響,以及對(duì)“細(xì)胞遷移通路”中主要蛋白CD44的RNA和蛋白水平的影響。通過(guò)多步實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步設(shè)想lnc RNA結(jié)合micro RNA(mi RNA)發(fā)揮其對(duì)下游基因的調(diào)控。采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)mi RNA與lnc RNA和CD44發(fā)生相互作用的位點(diǎn),構(gòu)建lnc RNA和CD44 3’UTR的熒光素酶報(bào)告基因,明確mi RNA結(jié)合lnc RNA和CD44的結(jié)構(gòu)域。觀察lnc RNA對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響,實(shí)驗(yàn)組注射穩(wěn)定敲低lnc RNA的MGC803細(xì)胞系,對(duì)照組注射穩(wěn)定表達(dá)空白載體的MGC803細(xì)胞系,并分離瘤體檢測(cè)lnc RNA、mi RNA及CD44在兩組中的表達(dá)差異。結(jié)果:Lnc RNAs在胃癌中的異常表達(dá)與拷CNV和轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。P53突變體R282W對(duì)lnc RNA-uc002kmd.存在轉(zhuǎn)錄激活作用。Lnc RNAs用于區(qū)分胃癌和正常黏膜組織的能力與m RNAs的相當(dāng)(兩者最低錯(cuò)誤率都為0.196)。建立的lnc RNAs預(yù)測(cè)組合包括九條lnc RNAs,差異表達(dá)最大的是uc002kmd.1,其在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁正常胃黏膜組織。48對(duì)胃癌和癌旁正常組織中運(yùn)用RT-q PCR技術(shù)檢測(cè)uc002kmd.1的表達(dá)量,胃癌組織中其表達(dá)量顯著增高。ROC曲線評(píng)價(jià)uc002kmd.1預(yù)測(cè)胃癌組織的敏感性和特異性很高,曲線下面積(area under curve,AUC)為0.714�？紤]到uc002kmd.1預(yù)測(cè)胃癌的能力,我們將其命名為GAPLINC(Gastric Adenocarcinoma Predictive Long Intergenic Non-Coding RNA)。GAPLINC的表達(dá)水平與胃癌病人腫瘤體積、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤累及3/5淋巴結(jié)組比率以及臨床分級(jí)等因素呈明顯正相關(guān)(P0.01)。GAPLINC高表達(dá)可顯著降低胃癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖和侵襲能力。通過(guò)表達(dá)譜芯片篩選和GSEA分析,GAPLINC下游基因中相當(dāng)一部分與“細(xì)胞轉(zhuǎn)移通路”密切相關(guān),GAPLINC的表達(dá)水平與CD44具有強(qiáng)相關(guān)性;GAPLINC發(fā)揮原癌基因功能部分依賴于CD44;裸鼠試驗(yàn)中體內(nèi)敲低GAPLINC可明顯抑制移植瘤生長(zhǎng),GALINC穩(wěn)定敲低組標(biāo)本中GAPLINC及CD44水平均低于對(duì)照組;熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)提示GAPLINC通過(guò)與CD44競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合mi R-211-3p,從而影響CD44的表達(dá)水平。結(jié)論:本研究提示CNV和轉(zhuǎn)錄活化影響胃癌中l(wèi)nc RNAs的表達(dá)。GAPLINC可作為影響胃癌發(fā)生發(fā)展的重要因子,在體內(nèi)組織學(xué)水平和體外細(xì)胞學(xué)水平調(diào)控胃癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等情況,從而影響胃癌患者的預(yù)后,且其功能的發(fā)揮部分依賴于CD44;GAPLINC通過(guò)與CD44競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合mi R-211-3p發(fā)揮對(duì)CD44的調(diào)控作用。
[Abstract]:In GSE39582 , we screened and established an lnc RNA composition for predicting the prognosis of patients with colorectal cancer . Risk score = ( 0.07826 * AKE24680 ) + ( - 0.14300 * AK123567 ) + ( - 0.19355 * CR22106 ) + ( - 0.19355 * CR22106 ) + ( - 0.20855 * B29649059 ) + ( - 0.20855 * ) . Ln RNAs combination was related to the GSE39582 detection set CRC patient DFS . Based on the median of Risk score ( RS ) , GSE39582 test set patients could be classified into high - risk groups and low - risk groups ( HR = 2.670 ; P0.0001 ) . In this study , the expression of lnc RNAs and mRNA in normal tissues of gastric cancer and normal tissues of gastric cancer were studied by means of high throughput chip ( RT - q ) PCR and chromatin immunocodeposition ( Ch IP ) . The expression level of lnc RNA and CD44 in gastric cancer was significantly higher than that of normal gastric mucosa . The expression level of lnc RNA and CD44 in gastric cancer was significantly higher than that of normal gastric mucosa . GAPLINC plays an important role in the development of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in inhibiting the proliferation , invasion and metastasis of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in inhibiting the growth of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in inhibiting the growth of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in the prognosis of gastric cancer patients .
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2038078