本文選題：March5 + 胚胎干細(xì)胞��； 參考：《中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：胚胎干細(xì)胞的多能性受到了胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)控,它對于胚胎干細(xì)胞將來在科研和醫(yī)療領(lǐng)域上的應(yīng)用是十分重要的,但是它的具體機(jī)制仍然不為人們所清楚。在我們的研究工作中,我們利用了一種經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒改造而來的載體pDisrup8,它可以隨機(jī)的插入宿主細(xì)胞的基因組,造成插入突變,從而篩選和發(fā)現(xiàn)對于小鼠胚胎干細(xì)胞維持多能性所需要的關(guān)鍵基因。通過這樣的方法,我們發(fā)現(xiàn)了基因March5參與干細(xì)胞干性的維持,它是一個泛素化連接酶。在敲低了March5后,會導(dǎo)致小鼠胚胎干細(xì)胞多能性標(biāo)記基因表達(dá)水平的降低,干細(xì)胞克隆形成的能力受到損害和體細(xì)胞重編程效率的下降。與此同時,我們發(fā)現(xiàn)March5受到Klf4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,并且可以催化Prkarla的63位賴氨酸連接的多聚泛素化。Prkarla是蛋白激酶A的一個組成部分,它可以介導(dǎo)Raf-1第259位絲氨酸的磷酸化進(jìn)而抑制下游MEK/ERK信號通路的活性。根據(jù)以往的報道,對MEK/ERK和GSK3信號通路的雙重抑制可以支持胚胎干細(xì)胞在無血清條件下的生長。我們發(fā)現(xiàn),外源表達(dá)March5或Klf4可以部分替代這個雙重抑制體系中的MEK抑制劑�？偠灾�,我們的研究揭示一條新的維持干性的從Klf4到March5再到ERK的信號通路。 根據(jù)近期的一些研究結(jié)果我們知道,體細(xì)胞重編程的過程也伴隨著細(xì)胞代謝狀態(tài)的重塑。蘇氨酸脫氫酶(TDH)是蘇氨酸代謝途徑中最重要的酶之一,而且它僅在小鼠胚胎干細(xì)胞中特異性表達(dá)。然而,TDH介導(dǎo)的蘇氨酸代謝是否會在體細(xì)胞重編程的過程中發(fā)揮作用仍然需要進(jìn)一步的研究。我們的研究表明,TDH確實有這樣的功能。敲低TDH會削弱重編程的誘導(dǎo)效率而過表達(dá)TDH會提高效率。同時,TDH受到microRNA-9的調(diào)控,而后者也會抑制重編程效率。另外,蛋白質(zhì)精氨酸轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)可以與TDH相互結(jié)合并使其第180位精氨酸發(fā)生甲基化。TDH的酶活性也因此受到PRMT5的調(diào)節(jié),但這種調(diào)節(jié)通過PRMT5甲基轉(zhuǎn)移酶活性依賴或不依賴兩種方式進(jìn)行的。重編程的誘導(dǎo)效率也會隨著加入TDH的基礎(chǔ)上再加入PRMT5而進(jìn)一步提高。這些數(shù)據(jù)說明TDH及其下游的蘇氨酸代謝參與到了體細(xì)胞重編程當(dāng)中去,并且在轉(zhuǎn)錄后和翻譯后兩個水平上受到了多種調(diào)控。 腫瘤細(xì)胞的重要特征之一就是Warburg效應(yīng),但其具體機(jī)制仍未完全清楚,而且長非編碼RNA是否參與其中并發(fā)揮怎樣的功能也不清楚。這里我們發(fā)現(xiàn)了一種受到c-myc調(diào)控的長非編碼RNA (IDH1-AS1),其通過與異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)結(jié)合,進(jìn)而穩(wěn)定其二聚體的形成,來維持其酶的活性,最終影響到腫瘤細(xì)胞HIF1A的水平而抑制Warburg效應(yīng)。在小鼠的異種移植物模型中,敲低IDH1-AS1可以促進(jìn)腫瘤生長�？傊�,這些數(shù)據(jù)表明IDH1-AS1是影響腫瘤Warburg效應(yīng)的一個重要因子,可以作為腫瘤治療的潛在靶點。
[Abstract]:The pluripotency of embryonic stem cells is precisely regulated by the intracellular signaling network, which is very important for the future application of embryonic stem cells in the field of scientific research and medicine, but its specific mechanism is still unclear. In our work, we used a retrovirus-modified vector, pDisrup8, that randomly inserted the genome of host cells, causing insertion mutations. The key genes needed to maintain pluripotency for mouse embryonic stem cells were screened and identified. In this way, we found that the gene March5 is involved in the maintenance of stem cell dryness, which is a ubiquitin ligase. After knocking down March5, the expression level of pluripotent marker genes of mouse embryonic stem cells was decreased, the ability of stem cell clone formation was impaired and the efficiency of somatic cell reprogramming was decreased. At the same time, we found that March5 is regulated by Klf4 transcription and catalyzes the polyubiquitin of 63 lysine ligation of Prkarla. Prkarla is a component of protein kinase A. It mediates the phosphorylation of serine at the 259th position of Raf-1 and inhibits the activity of the downstream MEK / ERK signaling pathway. According to previous reports, the dual inhibition of MEK / ERK and GSK3 signaling pathways can support the growth of embryonic stem cells in serum-free condition. We found that exogenous expression of March5 or Klf4 could partially replace MEK inhibitors in this dual inhibition system. All in all, our research reveals a new signal pathway that maintains dryness from Klf4 to March5 to ERK. According to some recent studies, somatic reprogramming is accompanied by remodeling of cell metabolic state. Threonine dehydrogenase (TDH) is one of the most important enzymes in threonine metabolism, and it is only specifically expressed in mouse embryonic stem cells. However, whether TDH mediated threonine metabolism may play a role in somatic reprogramming needs further study. Our research shows that TDH does have this function. Tapping down TDH weakens the induction efficiency of reprogramming, and over-expressing TDH improves efficiency. TDH is also regulated by microRNA-9, which also inhibits reprogramming efficiency. In addition, the protein arginine transferase 5 (PRMT5) can interact with TDH and make the enzyme activity of arginine methylation. TDH is regulated by PRMT5. But this regulation is done by PRMT5 methyltransferase activity dependent or independent. The induction efficiency of reprogramming will be further improved with the addition of PRMT5 on the basis of TDH. These data suggest that TDH and its downstream threonine metabolism are involved in somatic reprogramming and are regulated at both post-transcriptional and post-translational levels. Warburg effect is one of the important characteristics of tumor cells, but the mechanism of Warburg effect is not completely clear, and it is not clear whether long non-coding RNA participates in it and how it functions. Here we found a long non-coding RNAi IDH1-AS1G regulated by c-myc, which can stabilize the formation of dimer by binding with isocitrate dehydrogenase 1 and IDH1 to maintain its enzyme activity, and ultimately affect the level of HIF1A and inhibit Warburg effect. In mice xenografts, knocking down IDH 1-as 1 can promote tumor growth. All in all, these data suggest that IDH1-AS1 is an important factor affecting the Warburg effect and can be used as a potential target for tumor therapy.
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2036070