本文選題：乳腺癌 + CAFs��； 參考：《中華腫瘤防治雜志》2017年09期

【摘要】：目的研究報(bào)道,乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)在乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中起到促進(jìn)作用,而機(jī)制未明。本研究探討乳腺癌CAFs自噬調(diào)控對(duì)MCF-7細(xì)胞EMT進(jìn)程的影響。方法采用膠原酶消化法對(duì)CAFs及配對(duì)人乳腺癌正常成纖維細(xì)胞(NBFs)進(jìn)行原代培養(yǎng),采用免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行鑒定;建立CAFs和NBFs與MCF-7條件培養(yǎng)基(CM)共培養(yǎng)及Transwell小室共培養(yǎng)模型,共分為3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn),空白組即MCF-7單獨(dú)培養(yǎng)組(CON),對(duì)照組即正常乳腺癌成纖維細(xì)胞與MCF-7共培組(NBFs),實(shí)驗(yàn)組即乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞與MCF-7共培養(yǎng)組(CAFs)。Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移能力。蛋白印跡法檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞EMT上皮標(biāo)志分子E-cadherin蛋白和間質(zhì)標(biāo)志分子N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)情況;蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CAFs與NBFs自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1和p62表達(dá)差異;自噬抑制劑3MA處理CAFs后蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CAFs上述自噬相關(guān)蛋白表達(dá)差異;予以自噬抑制劑3MA預(yù)處理CAFs后,收集CM與MCF-7共培養(yǎng),分3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn),空白組即MCF-7單獨(dú)培養(yǎng)組(CON);對(duì)照組即MCF-7與CAFs-CM共培養(yǎng)組(CAFs-CM);實(shí)驗(yàn)組即MCF-7與3MA-CAFs-CM共培養(yǎng)組(3MA-CAFs-CM)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞EMT上皮標(biāo)志分子E-cadherin蛋白和間質(zhì)標(biāo)志分子N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)情況。結(jié)果通過酶消化法原代培養(yǎng)可獲取α-SMA(+)、Vimentin(+)E-cadherin(-)具有CAFs典型特征的肌成纖維細(xì)胞;Transwell侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)CAFs可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞侵襲、遷移;蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示,CAFs組MCF-7E-cadherin蛋白表達(dá)量為0.432±0.012,比NBFs組的0.585±0.02及空白組的0.659±0.016表達(dá)水平低,F=120.098,P0.05。而CAFs組間質(zhì)蛋白標(biāo)志物Vimentin蛋白表達(dá)量為0.309±0.065,比NBFs組的0.103±0.011及空白組的0.062±0.009表達(dá)低,F=42.395,P均0.05。CAFs組N-cadherin蛋白表達(dá)量為1.439±0.07比BNFs組的1.3347±0.028及空白組的1.176±0.021表達(dá)低,F=22.578,P0.05,提示CAFs促進(jìn)MCF-7發(fā)生EMT;CAFs細(xì)胞的Beclin1蛋白表達(dá)量為2.950±1.261,高于NBFs的0.862±0.727,t=-3.21,P0.05;CAFs細(xì)胞的LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度值比值為2.937±0.194,高于NBFs的2.314±0.224,t=-3.638,P0.05;而CAFs p62蛋白表達(dá)量為0.342±0.093,低于NBFs的0.750±0.021,t=7.432,P0.05,提示CAFs自噬水平高于NBFs。予以自噬抑制劑3MA處理CAFs后,處理組CAFs細(xì)胞的Beclin1蛋白表達(dá)量為0.211±0.008,低于未處理組的0.266±0.009,t=8.094,P0.05;處理組CAFs細(xì)胞的LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度值比值為0.496±0.004,低于未處理組的0.618±0.022,t=9.312,P0.05;而處理組的p62蛋白表達(dá)量為0.307±0.043,高于未處理組的0.143±0.008,t=-6.471,P0.05,說明3MA可以抑制CAFs自噬水平。自噬調(diào)控后共培養(yǎng),各組E-cadherin蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,F=44.157,P0.05;與對(duì)照組MCF-7細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)量1.209±0.010相比,CAFs-CM組的1.062±0.027表達(dá)下調(diào),而3MA-CAFs-CM組MCF-7細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)量為1.104±0.019,較CAFs-CM組表達(dá)上調(diào),均P0.05;3組MCF-7細(xì)胞Vimentin和N-cadherin表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。結(jié)論 CAFs能夠促進(jìn)MCF-7發(fā)生EMT并增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移能力,而抑制CAFs自噬后,其誘導(dǎo)的MCF-7發(fā)生EMT進(jìn)程受到抑制。
[Abstract]:Objective to study the effect of cancer associated fibroblasts (CAFs) on the invasion and metastasis of breast cancer, and the mechanism is not clear. This study explored the effect of autophagy on the EMT process of MCF-7 cells by CAFs autophagy in breast cancer. Methods the normal fibroblasts of CAFs and matched human breast cancer were used by the collagenase digestion method. Cells (NBFs) were cultured in primary culture and identified by immunofluorescence and Western blot; the co culture of CAFs and NBFs and MCF-7 conditioned medium (CM) and Transwell chamber co culture model were divided into 3 groups, the blank group, MCF-7 single culture group (CON), and the control group, the normal breast cancer fibroblast and MCF-7 co culture group (NBFs). In the experimental group, the invasion and migration of breast cancer related fibroblasts and MCF-7 co culture group (CAFs).Transwell were tested for the invasion and migration of MCF-7 cells in each group. The expression of the EMT epithelial markers E-cadherin protein and the interstitial marker molecule N-cadherin and Vimentin protein in MCF-7 cells were detected by Western blot; Western blot The expression of CAFs and NBFs autophagy related proteins LC3B, Beclin1 and p62 were detected, and the autophagy inhibitor 3MA was used to detect the difference in the expression of autophagy related proteins above the CAFs after CAFs, and the autophagy inhibitor, 3MA pretreated CAFs, was used to collect CM and MCF-7 co culture, and the blank group was a separate culture group, and the control group was the control group. MCF-7 and CAFs-CM co culture group (CAFs-CM), the experimental group was MCF-7 and 3MA-CAFs-CM co culture group (3MA-CAFs-CM). The expression of E-cadherin protein and interstitial marker N-cadherin and Vimentin protein of EMT epithelial markers in MCF-7 cells were detected by Western blot. E-cadherin (-) with CAFs typical characteristics of myofibroblast, Transwell invasion, migration experiment confirmed that CAFs can promote the invasion and migration of MCF-7 cells, and Western blot detection showed that the expression of MCF-7E-cadherin protein in CAFs group was 0.432 + 0.012, lower than that of NBFs group and 0.659 + 0.016 in blank group, F=120.098, P0.05.. The expression of Vimentin protein in group CAFs was 0.309 + 0.065, lower than that of group NBFs and 0.062 + 0.009 in blank group, F=42.395, P 0.05.CAFs group N-cadherin protein expression was 1.439 + 0.07 compared with BNFs group 1.3347 + 0.028 and 1.176 + 0.021 table of blank group was low, F=22.578, P0.05, suggesting CAFs promoted MCF-7 to occur. MT, the expression of Beclin1 protein in CAFs cells was 2.950 + 1.261, higher than 0.862 + 0.727, t=-3.21, P0.05, and LC3B II /LC3B I ratio of CAFs cells was 2.937 + 0.194, higher than NBFs 2.314 + 0.224, t=-3.638, P0.05, which was 0.342 + 0.093, lower than 0.750 + 0.021, suggesting autophagy level The Beclin1 protein expression of CAFs cells in the treatment group was 0.211 + 0.008, which was 0.211 + 0.008, lower than 0.266 + 0.009, t=8.094, P0.05, and the ratio of LC3B II /LC3B I in the treated group was 0.496 + 0.004, lower than 0.618 + 0.022, t=9.312, P0.05. The expression was 0.307 + 0.043, higher than that of the untreated group, 0.143 + 0.008, t=-6.471, P0.05, indicating that 3MA could inhibit the autophagy level of CAFs. After autophagy, the expression of E-cadherin protein was statistically significant, F=44.157, P0.05, and the E-cadherin protein expression of MCF-7 cells in the control group was 1.209 + 0.010, and 1.062 + 0.027 in CAFs-CM group. The expression of E-cadherin protein in MCF-7 cells in group 3MA-CAFs-CM was 1.104 + 0.019, and the expression was up to P0.05 in group CAFs-CM. The expression of Vimentin and N-cadherin in the 3 groups of MCF-7 cells was statistically significant. P0.05. conclusion CAFs can promote MCF-7 EMT and enhance its invasion and metastasis ability. The MT process is suppressed.
【作者單位】： 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院普外科;
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2033705