本文選題：EGFR-TKI + LC3-Ⅱ�。� 參考：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分自噬與非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI耐藥的關(guān)系目的：構(gòu)建EGFR-TKI耐藥細(xì)胞株并探索EGFR-TKI耐藥與自噬活動(dòng)的關(guān)系。方法：選取4種NSCLC細(xì)胞系HCC827, A549, H460和H1975,進(jìn)行基因檢測以驗(yàn)證其EGFR突變狀態(tài),并通過CCK8測定其對(duì)erlotinib的敏感性。以EGFR-TKI敏感細(xì)胞HCC827為基礎(chǔ),通過長期且濃度遞增的erlotinib處理以誘導(dǎo)出EGFR-TKI耐藥細(xì)胞株,并通過CCK8鑒定其對(duì)erlotinib的敏感性,命名為HCC827-R。通過Western blotting檢測HCC827, A549, H460, H1975和HCC827-R5種細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬水平,并通過GFP-LC3和CQ(chloroquine)進(jìn)一步驗(yàn)證HCC827和HCC827-R的自噬流水平。通過抑制劑(CQ或3-MA)或siRNA抑制基礎(chǔ)自噬觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：EGFR基因檢測結(jié)果為：HCC827(E746-A750 deletion), A549(wild type), H460(wild type), H1975(L858R and T790M),通過CCK8藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)HCC827對(duì)erlotinib敏感,而A549,H460,H1975和HCC827-R對(duì)erlotinib抗拒,其中HCC827-R對(duì)erlotinib的IC50值大于100gM。綜合比較HCC827, A549, H460, H1975和HCC827-R的EGFR-TKI敏感性和基礎(chǔ)自噬水平發(fā)現(xiàn),從HCC827到HCC827-R,細(xì)胞對(duì)erlotinib的藥物敏感性逐漸降低,而LC3-Ⅱ水平,即基礎(chǔ)自噬水平逐漸增高。通過GFP-LC3和CQ的介入進(jìn)一步證實(shí),HCC827-R的基礎(chǔ)自噬流水平明顯高于HCC827。以3-MA或siRNA抑制基礎(chǔ)自噬后,HCC827和HCC827-R的增殖未受明顯影響。結(jié)論：相對(duì)于EGFR-TKI敏感細(xì)胞,EGFR-TKI耐藥細(xì)胞擁有更高的基礎(chǔ)自噬水平,對(duì)EGFR-TKI的敏感性與細(xì)胞基礎(chǔ)自噬水平之間存在負(fù)相關(guān)性,基礎(chǔ)自噬活動(dòng)不是細(xì)胞增殖的必需因素。第二部分自噬對(duì)非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI耐藥的調(diào)控作用目的：進(jìn)一步探索自噬在NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI耐藥中的作用以及抑制自噬對(duì)EGFR-TKI耐藥的影響。方法：通過不同時(shí)間不同濃度的erlotinib處理HCC827,A549,H1975和HCC827-R細(xì)胞,觀察erlotinib對(duì)細(xì)胞自噬活動(dòng)的影響。將自噬抑制劑(CQ或3-MA)與erlotinib聯(lián)合應(yīng)用于HCC827,A549,H1975和HCC827-R細(xì)胞,觀察二者的聯(lián)合作用對(duì)自噬活動(dòng)以及細(xì)胞增殖的影響。通過Annexin V和PI雙染檢測不同濃度的CQ或CQ與erlotinib聯(lián)用對(duì)H1975或HCC827-R凋亡活動(dòng)的影響,并以Western blotting進(jìn)一步觀察PARP1和caspase 3的變化。在CQ和erlotinib聯(lián)合作用下,以JC-1染色觀察線粒體膜電位的變化,并分別提取胞漿和線粒體蛋白以Western blotting檢測胞漿和線粒體中cytochrome c的含量。結(jié)果：Erlotinib呈時(shí)間依賴性的誘導(dǎo)HCC827,A549,H1975和HCC827-R細(xì)胞自噬水平升高,而這一作用可以被自噬抑制劑3-MA或CQ阻斷。3-MA或CQ均與erlotinib表現(xiàn)出協(xié)同作用,抑制了HCC827, A549, H1975和HCC827-R的細(xì)胞增殖,其中3-MA單藥對(duì)細(xì)胞生長無明顯的抑制作用,而CQ單藥使用時(shí)細(xì)胞生長和克隆形成均受到顯著抑制,提示作用于不同靶點(diǎn)的自噬抑制劑對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖具有不同的影響。CQ與erlotinib聯(lián)合作用引起了H1975和HCC827-R凋亡水平增高,激活了PARP1與caspase 3,而caspase抑制劑z-VAD fmk逆轉(zhuǎn)了這一聯(lián)合作用引起的細(xì)胞生長抑制。此外,CQ與erlotinib聯(lián)合應(yīng)用還引起了線粒體膜電位的丟失和線粒體膜通透性的降低,表現(xiàn)為cytochrome c從線粒體釋放入胞漿。結(jié)論：自噬抑制劑(3-MA或CQ)抑制了EGFR-TKI引起的自噬反應(yīng)并進(jìn)而逆轉(zhuǎn)了NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的耐藥,CQ與erlotinib的聯(lián)合應(yīng)用通過降低線粒體的膜電位和膜通透性引起NSCLC細(xì)胞發(fā)生caspase依賴性的凋亡反應(yīng)。第三部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在cQ逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥中的作用及機(jī)制目的：觀察線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活動(dòng)在CQ逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥中的作用。方法：通過GFP-LC3與線粒體示蹤劑mitotracker的共定位情況觀察線粒體自噬是否參與了CQ與erlotinib的聯(lián)合作用。在CQ與erlotinib的聯(lián)合作用下以Western blotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白EIF2α-CHOP的水平,并通過siRNA靶向敲除CHOP觀察其對(duì)H1975細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的影響。進(jìn)而,通過JC.1染色和Western blotting檢測靶向敲除CHOP后CQ與erlotinib聯(lián)合作用下線粒體膜電位和膜通透性變化。最后,通過建立H1975移植瘤模型,檢測CQ與erlotinib聯(lián)合作用對(duì)H1975移植瘤增殖的影響。結(jié)果：在CQ與erlotinib聯(lián)合作用下,GFP-LC3未能與mitotracker形成熒光共定位,說明線粒體自噬未參與CQ與erlotinib的聯(lián)合作用。通過Western blotting發(fā)現(xiàn)CQ與erlotinib聯(lián)合作用引起了EIF2α-CHOP通路的活化,說明其引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。對(duì)CHOP的敲除,逆轉(zhuǎn)了CQ與erlotinib聯(lián)合作用引起的凋亡反應(yīng)和細(xì)胞生長抑制,并且抑制了線粒體膜電位和膜通透性的變化。在體內(nèi)試驗(yàn)中,CQ與erlotinib聯(lián)合作用顯著抑制了H1975移植瘤的生長。結(jié)論：CQ與erlotinib聯(lián)合作用通過介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而引起線粒體膜電位和通透性的變化,最終引起凋亡,其中CHOP起到了凋亡信號(hào)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激向線粒體凋亡途徑傳導(dǎo)的中介作用。
[Abstract]:The first part of the relationship between autophagy and EGFR-TKI resistance in non-small cell lung cancer: to construct a EGFR-TKI resistant cell line and explore the relationship between EGFR-TKI resistance and autophagy. Methods: select 4 NSCLC cell lines, HCC827, A549, H460 and H1975, to test their EGFR mutation status and determine their sensitivity to erlotinib by CCK8. On the basis of EGFR-TKI sensitive cell HCC827, the EGFR-TKI resistant cell line was induced by long-term and increasing erlotinib treatment, and the sensitivity to erlotinib was identified by CCK8. It was named HCC827-R. through Western blotting to detect the basic autophagy level of HCC827, A549, H460, and cells. C3 and CQ (chloroquine) further verify the level of autophagic flow in HCC827 and HCC827-R. The effects of autophagy on the basal autophagy of the inhibitor (CQ or 3-MA) or siRNA are observed. Perceptual detection found that HCC827 is sensitive to erlotinib, while A549, H460, H1975 and HCC827-R are resistant to erlotinib. The IC50 values of HCC827-R to erlotinib are greater than 100gM.. Decrease, and LC3- II level, the level of basic autophagy increased gradually. Through the intervention of GFP-LC3 and CQ, the basal autophagy level of HCC827-R was significantly higher than that of HCC827. with 3-MA or siRNA inhibition of the basal autophagy, and the proliferation of HCC827 and HCC827-R was not significantly affected. Conclusion: for EGFR-TKI sensitive cells, EGFR-TKI drug-resistant cells are owned. Higher basic autophagy level, negative correlation between EGFR-TKI sensitivity and cell based autophagy level, basic autophagy is not a necessary factor for cell proliferation. Second the role of autophagy in the regulation of EGFR-TKI resistance in non small cell lung cancer: further explore the role of autophagy in the resistance of NSCLC cells to EGFR-TKI And the effect of inhibition of autophagy on EGFR-TKI resistance. Methods: the effects of erlotinib on the autophagy activity of HCC827, A549, H1975 and HCC827-R cells were observed at different concentrations of erlotinib at different times. The combined effects of the autophagy inhibitor (CQ or 3-MA) and erlotinib were combined with erlotinib to observe the combined effect of the two. The effects on autophagy and cell proliferation. The effects of CQ or CQ on the apoptosis of H1975 or HCC827-R were detected by Annexin V and PI double staining, and the changes of PARP1 and caspase 3 were further observed with Western blotting. The cytoplasm and mitochondrial proteins were extracted with Western blotting to detect the cytochrome C in the cytoplasm and mitochondria. Results: Erlotinib was time dependent induced HCC827, and the autophagy level of A549, H1975 and HCC827-R cells increased, and this effect could be associated with the inhibition of 3-MA or CQ of autophagic inhibitors. The same effect inhibited the cell proliferation of HCC827, A549, H1975 and HCC827-R, in which 3-MA single drug had no obvious inhibitory effect on cell growth, while the cell growth and clone formation of CQ single drug were significantly inhibited, suggesting that the autophagy inhibitors acting at different targets had different effects on the proliferation of NSCLC cells with the combination of.CQ and erlotinib. The effect caused the increase of apoptosis level of H1975 and HCC827-R, activation of PARP1 and caspase 3, and caspase inhibitor z-VAD fmk reverses the cell growth inhibition caused by this combination. In addition, the combination of CQ and erlotinib causes the loss of mitochondrial membrane potential and the decrease of mitochondrial membrane permeability, showing cytochrome c from the mitochondria. Release into the cytoplasm. Conclusion: autophagy inhibitor (3-MA or CQ) inhibits the autophagy induced by EGFR-TKI and then reverses the resistance of NSCLC cells to EGFR-TKI. The combination of CQ and erlotinib can induce caspase dependent apoptosis in NSCLC cells by reducing mitochondrial membrane potential and membrane permeability. Third part of endoplasmic reticulum stress The role and mechanism of cQ in reversing EGFR-TKI resistance: To observe the role of mitochondrial and endoplasmic reticulum activity in reversing EGFR-TKI resistance by CQ. Methods: whether mitochondrial autophagy is involved in the co operation of CQ and erlotinib through the co localization of GFP-LC3 and mitochondrial tracer mitotracker. In combination of CQ and erlotinib The level of endoplasmic reticulum stress pathway protein EIF2 alpha -CHOP was detected by Western blotting, and the effect of siRNA targeting CHOP on the apoptosis and cell proliferation of H1975 cells was observed. Then, the mitochondrial membrane potential and membrane permeability under the joint action of CQ and CQ were detected by JC.1 staining and Western blotting. The effect of the combination of CQ and erlotinib on the proliferation of H1975 xenografts was detected by establishing a H1975 xenograft model. Results: under the combination of CQ and erlotinib, GFP-LC3 failed to form a co localization with mitotracker, indicating that mitochondrial autophagy did not participate in the combination of CQ and erlotinib. The activation caused the activation of the EIF2 alpha -CHOP pathway, indicating that it causes the endoplasmic reticulum stress response. The knockout of CHOP reverses the apoptosis response and cell growth inhibition caused by the combination of CQ and erlotinib, and inhibits the changes in mitochondrial membrane potential and membrane permeability. In vivo tests, the combination of CQ and erlotinib significantly inhibits H197. 5 the growth of transplanted tumor. Conclusion: the combination of CQ and erlotinib can induce the changes of mitochondrial membrane potential and permeability by mediating the endoplasmic reticulum stress response, and eventually induce apoptosis, in which CHOP acts as the intermediary of apoptosis signal transduction from endoplasmic reticulum stress to mitochondrial apoptosis pathway.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2023074