發(fā)布時(shí)間：2018-06-14 13:54

  本文選題：胃癌 + 柚皮素�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：胃癌(gastric cancer,GC)是世界上癌癥致死的第二大因素,在中國(guó)GC患者的死亡數(shù)量占所有癌癥患者死亡數(shù)量的約23㳠。作為一種高度惡性的腫瘤,GC具有無限制性細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等特性。和其它惡性腫瘤一樣,GC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程。首先,癌細(xì)胞無限制性生長(zhǎng);然后癌細(xì)胞自原發(fā)腫瘤脫落并侵襲至周圍組織或進(jìn)入血管和淋巴管;最終,癌細(xì)胞停留并定居在靶器官并形成轉(zhuǎn)移腫瘤。大多數(shù)的GC病人在確診時(shí)已進(jìn)入晚期,盡管放化療已用于治療GC,但GC的預(yù)后仍不樂觀。中藥取材方便、價(jià)廉、毒副作用小,故中藥及其有效成分抗腫瘤的機(jī)制研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。柚皮素(naringenin,Nar),自柑橘類水果中提取,屬于二氫黃酮類化合物。它的生物活性廣泛,包括:抗癌基因活性、抗動(dòng)脈粥樣硬化活性、抗炎作用、抗氧化作用等。和其它黃酮類化合物一樣,Nar可以通過一系列作用機(jī)制抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng),例如:破壞口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制人K562細(xì)胞白血病的細(xì)胞增殖。另有報(bào)道顯示,Nar可以抑制癌細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移和組織侵襲。有研究證實(shí),Nar對(duì)幾種典型的癌癥具有有效的抗癌作用,例如:膀胱癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌。Nar的器官特異性癌癥化療作用和療效已被公認(rèn)并且Nar被認(rèn)為是癌癥的一種化療或治療藥物。而且,Nar對(duì)GC的初步抗癌活性也已被證實(shí)。近幾年的研究顯示Nar不僅可以抑制GC中的beta-catenin/Tcf信號(hào)通路,還可以上調(diào)GC誘導(dǎo)大鼠的氧化還原狀態(tài)從而降低患癌的風(fēng)險(xiǎn)。然而,Nar對(duì)GC發(fā)展轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制仍有待闡明�；谏鲜鲅芯�,為了進(jìn)一步了解Nar對(duì)GC是否具有治療作用,我們研究了:(1)Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響。(2)Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響。(3)Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響。(4)Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT信號(hào)通路的影響。最終闡明了Nar可以明顯抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些作用與AKT的磷酸化抑制和下游靶因子的表達(dá)有關(guān)。為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。第一部分nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響目的:研究nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響,明確nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖是否具有抑制作用。方法:sgc7901細(xì)胞為人gc細(xì)胞,購買于上海生命科學(xué)細(xì)胞資源中心,并將細(xì)胞在rpmi1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有:10%胎牛血清、100units/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素。培養(yǎng)箱的co2濃度維持在5%,溫度維持在37℃。濃度為0.25%的胰酶(含有0.02%edta)用于細(xì)胞傳代,每周2~3次。采用四甲基噻唑藍(lán)法(methylthiazolyltetrazolium,mtt)研究nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞生長(zhǎng)率的影響。將sgc7901細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中并孵育24h,每種處理方式設(shè)6個(gè)復(fù)孔。用不同濃度(0、5、10、20、40、80、160μmol/l)的nar處理sgc7901細(xì)胞48h,另外用40μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞0、24、48和72h,觀察sgc7901細(xì)胞生長(zhǎng)率的變化。采用western-blot法檢測(cè)人胃癌sgc7901細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,pcna)蛋白的表達(dá)變化。用濃度為0、20、40、80μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞48h后收集細(xì)胞,用于實(shí)驗(yàn)。觀察人胃癌sgc7901細(xì)胞增殖活性的變化。結(jié)果:1mtt結(jié)果顯示:nar濃度為5μmol/l時(shí),sgc7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率沒有明顯的改變。但是,濃度為10、20、40、80和160μmol/l時(shí),nar對(duì)sgc7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率起劑量依賴性抑制作用(p0.05);同時(shí),nar濃度為40μmol/l,分別處理sgc7901細(xì)胞0、24、48和72h時(shí),nar對(duì)sgc7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率起時(shí)間依賴性抑制作用(p0.05)。2western-blot結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時(shí),nar對(duì)sgc7901細(xì)胞pcna蛋白表達(dá)起劑量依賴性抑制作用(p0.05)。結(jié)論:nar呈劑量、時(shí)間依賴性的抑制人胃癌sgc7901細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。第二部分nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響目的:研究nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響,進(jìn)而探討nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞遷移和侵襲的作用及其可能的作用機(jī)制。方法:細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞遷移的影響。sgc7901細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在12孔培養(yǎng)板內(nèi),生長(zhǎng)至80~90%融合后用于實(shí)驗(yàn)。用200μl槍頭將單層細(xì)胞劃痕后用pbs沖洗兩遍,然后用濃度為0、20、40、80μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞48h,另外用40μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞24、48和72h,觀察sgc7901細(xì)胞遷移活性的變化。細(xì)胞遷移活性用遷移至劃痕處的細(xì)胞數(shù)量來表示。transwell小室法用于檢測(cè)nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞侵襲活性的影響。用濃度為0、20、40、80μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞48h,另外用40μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞24,48和72h,觀察sgc7901細(xì)胞侵襲活性的變化。實(shí)時(shí)定量rt-pcr和western-blot用于檢測(cè)人胃癌sgc7901細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp2和mmp9)及其抑制劑(timp1和timp2)的mrna和蛋白的表達(dá)變化。用濃度為0、20、40、80μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞48h后收集細(xì)胞,用于實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時(shí),nar對(duì)sgc7901細(xì)胞的遷移活性起劑量依賴性抑制作用(p0.05);同時(shí),nar濃度為40μmol/l,分別處理sgc7901細(xì)胞24,48和72h時(shí),sgc7901細(xì)胞的遷移活性與對(duì)照組比較明顯下降(p0.05)。2transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時(shí),nar對(duì)sgc7901細(xì)胞的侵襲活性起劑量依賴性抑制作用(p0.01);同時(shí),nar濃度為40μmol/l,分別處理sgc7901細(xì)胞24、48和72h時(shí),sgc7901細(xì)胞的遷移活性與對(duì)照組比較明顯下降(p0.01)。3實(shí)時(shí)定量rt-pcr和western-blot結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時(shí),nar對(duì)sgc7901細(xì)胞mmp2和mmp9的mrna和蛋白表達(dá)呈劑量依賴性抑制作用(p0.05),但對(duì)timp1和timp2表達(dá)沒有明顯影響。結(jié)論:nar可以抑制人胃癌sgc7901細(xì)胞的遷移和侵襲活性,并且降低mmp2和mmp9的表達(dá)。表明nar可能通過降低mmp2和mmp9的表達(dá)對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用。第三部分nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞凋亡的影響目的:研究nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)而探討nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞凋亡作用及其可能的作用機(jī)制。方法:細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分。流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)人胃癌sgc7901細(xì)胞的凋亡率。用濃度為0、20、40和80μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞48h,另外用40μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞24、48和72h后,用annexinv-fitc孵育細(xì)胞,然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)時(shí)定量rt-pcr和western-blot用于檢測(cè)人胃癌sgc7901細(xì)胞凋亡相關(guān)因子bax、bcl-2、survivin和cleaved-caspase-3的mrna和蛋白的表達(dá)變化。用濃度20、40和80μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞48h后收集細(xì)胞,用于實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時(shí),nar對(duì)sgc7901細(xì)胞的凋亡率起劑量依賴性促進(jìn)作用(p0.05);同時(shí),nar濃度為40μmol/l,分別處理sgc7901細(xì)胞24、48和72h時(shí),sgc7901細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較明顯增加(p0.05)。2實(shí)時(shí)定量rt-pcr和western-blot結(jié)果顯示:nar濃度為20、40和80μmol/l時(shí),sgc7901細(xì)胞的促凋亡因子bax和cleaved-caspase-3的mrna和蛋白表達(dá)明顯增加(p0.05),而抑制凋亡的bcl-2和survivin的mrna和蛋白表達(dá)明顯減少(p0.05)。結(jié)論:nar以劑量和時(shí)間依賴性促進(jìn)人胃癌sgc7901細(xì)胞的凋亡。nar通過增加sgc7901細(xì)胞的促凋亡因子bax和cleaved-caspase-3的mrna和蛋白表達(dá),減少抑制凋亡因子bcl-2和survivin的mrna和蛋白表達(dá)而起到促進(jìn)sgc7901細(xì)胞的凋亡作用。第四部分nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞akt信號(hào)通路的影響目的:研究nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞akt信號(hào)通路的影響,進(jìn)而探討nar是否通過下調(diào)akt信號(hào)通路抑制人胃癌sgc7901細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。方法:細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分。首先,分別用濃度為0、20、40和80μmol/l的nar對(duì)sgc7901細(xì)胞進(jìn)行處理,時(shí)間為24、48和72h;然后收集細(xì)胞進(jìn)行western-blot檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)為:akt和p-akt(磷酸化akt)。然后,將細(xì)胞分為四組:1組,不用任何試劑處理;2組,用濃度為50μmol/l的ly294002(akt抑制劑)處理sgc7901細(xì)胞2h;3組,濃度為40μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞48h;4組,首先用濃度為50μmol/l的ly294002處理sgc7901細(xì)胞2h,然后用濃度為40μmol/l的nar處理sgc7901細(xì)胞48h。最后,用mtt檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)率;用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲活性;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況;用western-blot檢測(cè)上述活性相關(guān)因子和akt信號(hào)通路的蛋白表達(dá)情況,檢測(cè)指標(biāo)為:pcna、bax、bcl-2、mmp2、mmp9、timp1、timp2、akt和p-akt。結(jié)果:1nar對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞akt蛋白表達(dá)和磷酸化的影響。western-blot研究結(jié)果顯示:nar以劑量和時(shí)間依賴方式抑制sgc7901細(xì)胞akt的磷酸化,但akt蛋白表達(dá)沒有明顯的變化。2nar和akt抑制劑ly294002對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。mtt研究結(jié)果顯示:nar和ly294002均能降低sgc7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率(p0.01),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步降低sgc7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率(p0.01)。3nar和akt抑制劑ly294002對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:nar和ly294002均能降低sgc7901細(xì)胞的遷移活性(p0.01),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步降低sgc7901細(xì)胞的遷移活性(p0.01)。transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:nar和ly294002均能降低sgc7901細(xì)胞的侵襲活性(p0.01),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步降低sgc7901細(xì)胞的侵襲活性(p0.01)。4nar和akt抑制劑ly294002對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:nar和ly294002均能促進(jìn)sgc7901細(xì)胞凋亡(p0.01),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)sgc7901細(xì)胞的凋亡(p0.01)。5 Nar和AKT抑制劑LY294002對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡相關(guān)因子及AKT蛋白表達(dá)和磷酸化的作用。為了進(jìn)一步確認(rèn)Nar與AKT抑制劑LY294002聯(lián)合使用對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及AKT蛋白表達(dá)和磷酸化的作用機(jī)制,采用Western-blot方法檢測(cè)了PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、AKT和p-AKT的表達(dá)變化。Western-blot研究結(jié)果顯示:Nar和LY294002均能增加SGC7901細(xì)胞Bax的表達(dá)(P0.05),并且兩種藥物共同作用于SGC7901細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步增加其表達(dá)(P0.05,);Nar和LY294002均能降低SGC7901細(xì)胞PCNA、Bcl-2、MMP2、MMP9、p-AKT的表達(dá)(P0.05),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步降低其的表達(dá)(P0.05);但是,Nar和LY294002對(duì)SGC7901細(xì)胞AKT、TIMP1、TIMP2的表達(dá)均沒有明顯影響。結(jié)論:Nar可以抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT的磷酸化,Nar和LY294002聯(lián)合用藥可以協(xié)同作用進(jìn)一步抑制SGC7901細(xì)胞AKT的磷酸化。Nar可能是通過抑制AKT的磷酸化,下調(diào)AKT信號(hào)通路,抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2017623