本文選題：胃癌 + 柚皮素��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：胃癌(gastric cancer,GC)是世界上癌癥致死的第二大因素,在中國GC患者的死亡數(shù)量占所有癌癥患者死亡數(shù)量的約23㳠。作為一種高度惡性的腫瘤,GC具有無限制性細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等特性。和其它惡性腫瘤一樣,GC的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程。首先,癌細胞無限制性生長;然后癌細胞自原發(fā)腫瘤脫落并侵襲至周圍組織或進入血管和淋巴管;最終,癌細胞停留并定居在靶器官并形成轉(zhuǎn)移腫瘤。大多數(shù)的GC病人在確診時已進入晚期,盡管放化療已用于治療GC,但GC的預(yù)后仍不樂觀。中藥取材方便、價廉、毒副作用小,故中藥及其有效成分抗腫瘤的機制研究已成為當今醫(yī)學(xué)研究的熱點。柚皮素(naringenin,Nar),自柑橘類水果中提取,屬于二氫黃酮類化合物。它的生物活性廣泛,包括:抗癌基因活性、抗動脈粥樣硬化活性、抗炎作用、抗氧化作用等。和其它黃酮類化合物一樣,Nar可以通過一系列作用機制抑制癌細胞的生長,例如:破壞口腔鱗狀細胞癌的細胞周期進程,抑制人K562細胞白血病的細胞增殖。另有報道顯示,Nar可以抑制癌細胞的遷移、轉(zhuǎn)移和組織侵襲。有研究證實,Nar對幾種典型的癌癥具有有效的抗癌作用,例如:膀胱癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌。Nar的器官特異性癌癥化療作用和療效已被公認并且Nar被認為是癌癥的一種化療或治療藥物。而且,Nar對GC的初步抗癌活性也已被證實。近幾年的研究顯示Nar不僅可以抑制GC中的beta-catenin/Tcf信號通路,還可以上調(diào)GC誘導(dǎo)大鼠的氧化還原狀態(tài)從而降低患癌的風(fēng)險。然而,Nar對GC發(fā)展轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制仍有待闡明�；谏鲜鲅芯�,為了進一步了解Nar對GC是否具有治療作用,我們研究了:(1)Nar對人胃癌SGC7901細胞生長、增殖的影響。(2)Nar對人胃癌SGC7901細胞遷移和侵襲的影響。(3)Nar對人胃癌SGC7901細胞凋亡的影響。(4)Nar對人胃癌SGC7901細胞AKT信號通路的影響。最終闡明了Nar可以明顯抑制人胃癌SGC7901細胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細胞凋亡。這些作用與AKT的磷酸化抑制和下游靶因子的表達有關(guān)。為其進一步的臨床應(yīng)用提供實驗及理論依據(jù)。第一部分nar對人胃癌sgc7901細胞生長、增殖的影響目的:研究nar對人胃癌sgc7901細胞生長、增殖的影響,明確nar對人胃癌sgc7901細胞生長、增殖是否具有抑制作用。方法:sgc7901細胞為人gc細胞,購買于上海生命科學(xué)細胞資源中心,并將細胞在rpmi1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有:10%胎牛血清、100units/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素。培養(yǎng)箱的co2濃度維持在5%,溫度維持在37℃。濃度為0.25%的胰酶(含有0.02%edta)用于細胞傳代,每周2~3次。采用四甲基噻唑藍法(methylthiazolyltetrazolium,mtt)研究nar對人胃癌sgc7901細胞生長率的影響。將sgc7901細胞以每孔1×104個細胞的密度接種在96孔板中并孵育24h,每種處理方式設(shè)6個復(fù)孔。用不同濃度(0、5、10、20、40、80、160μmol/l)的nar處理sgc7901細胞48h,另外用40μmol/l的nar處理sgc7901細胞0、24、48和72h,觀察sgc7901細胞生長率的變化。采用western-blot法檢測人胃癌sgc7901細胞增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,pcna)蛋白的表達變化。用濃度為0、20、40、80μmol/l的nar處理sgc7901細胞48h后收集細胞,用于實驗。觀察人胃癌sgc7901細胞增殖活性的變化。結(jié)果:1mtt結(jié)果顯示:nar濃度為5μmol/l時,sgc7901細胞的生長率沒有明顯的改變。但是,濃度為10、20、40、80和160μmol/l時,nar對sgc7901細胞的生長率起劑量依賴性抑制作用(p0.05);同時,nar濃度為40μmol/l,分別處理sgc7901細胞0、24、48和72h時,nar對sgc7901細胞的生長率起時間依賴性抑制作用(p0.05)。2western-blot結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時,nar對sgc7901細胞pcna蛋白表達起劑量依賴性抑制作用(p0.05)。結(jié)論:nar呈劑量、時間依賴性的抑制人胃癌sgc7901細胞的生長、增殖。第二部分nar對人胃癌sgc7901細胞遷移和侵襲的影響目的:研究nar對人胃癌sgc7901細胞遷移和侵襲的影響,進而探討nar對人胃癌sgc7901細胞遷移和侵襲的作用及其可能的作用機制。方法:細胞培養(yǎng)方法同第一部分。細胞劃痕實驗用于檢測nar對人胃癌sgc7901細胞遷移的影響。sgc7901細胞以每孔5×104個細胞的密度接種在12孔培養(yǎng)板內(nèi),生長至80~90%融合后用于實驗。用200μl槍頭將單層細胞劃痕后用pbs沖洗兩遍,然后用濃度為0、20、40、80μmol/l的nar處理sgc7901細胞48h,另外用40μmol/l的nar處理sgc7901細胞24、48和72h,觀察sgc7901細胞遷移活性的變化。細胞遷移活性用遷移至劃痕處的細胞數(shù)量來表示。transwell小室法用于檢測nar對人胃癌sgc7901細胞侵襲活性的影響。用濃度為0、20、40、80μmol/l的nar處理sgc7901細胞48h,另外用40μmol/l的nar處理sgc7901細胞24,48和72h,觀察sgc7901細胞侵襲活性的變化。實時定量rt-pcr和western-blot用于檢測人胃癌sgc7901細胞基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp2和mmp9)及其抑制劑(timp1和timp2)的mrna和蛋白的表達變化。用濃度為0、20、40、80μmol/l的nar處理sgc7901細胞48h后收集細胞,用于實驗。結(jié)果:1細胞劃痕實驗結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時,nar對sgc7901細胞的遷移活性起劑量依賴性抑制作用(p0.05);同時,nar濃度為40μmol/l,分別處理sgc7901細胞24,48和72h時,sgc7901細胞的遷移活性與對照組比較明顯下降(p0.05)。2transwell小室實驗結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時,nar對sgc7901細胞的侵襲活性起劑量依賴性抑制作用(p0.01);同時,nar濃度為40μmol/l,分別處理sgc7901細胞24、48和72h時,sgc7901細胞的遷移活性與對照組比較明顯下降(p0.01)。3實時定量rt-pcr和western-blot結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時,nar對sgc7901細胞mmp2和mmp9的mrna和蛋白表達呈劑量依賴性抑制作用(p0.05),但對timp1和timp2表達沒有明顯影響。結(jié)論:nar可以抑制人胃癌sgc7901細胞的遷移和侵襲活性,并且降低mmp2和mmp9的表達。表明nar可能通過降低mmp2和mmp9的表達對人胃癌sgc7901細胞的遷移和侵襲發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用。第三部分nar對人胃癌sgc7901細胞凋亡的影響目的:研究nar對人胃癌sgc7901細胞凋亡的影響,進而探討nar對人胃癌sgc7901細胞凋亡作用及其可能的作用機制。方法:細胞培養(yǎng)方法同第一部分。流式細胞術(shù)用于檢測人胃癌sgc7901細胞的凋亡率。用濃度為0、20、40和80μmol/l的nar處理sgc7901細胞48h,另外用40μmol/l的nar處理sgc7901細胞24、48和72h后,用annexinv-fitc孵育細胞,然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實時定量rt-pcr和western-blot用于檢測人胃癌sgc7901細胞凋亡相關(guān)因子bax、bcl-2、survivin和cleaved-caspase-3的mrna和蛋白的表達變化。用濃度20、40和80μmol/l的nar處理sgc7901細胞48h后收集細胞,用于實驗。結(jié)果:1流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:nar濃度為0、20、40和80μmol/l時,nar對sgc7901細胞的凋亡率起劑量依賴性促進作用(p0.05);同時,nar濃度為40μmol/l,分別處理sgc7901細胞24、48和72h時,sgc7901細胞凋亡率與對照組比較明顯增加(p0.05)。2實時定量rt-pcr和western-blot結(jié)果顯示:nar濃度為20、40和80μmol/l時,sgc7901細胞的促凋亡因子bax和cleaved-caspase-3的mrna和蛋白表達明顯增加(p0.05),而抑制凋亡的bcl-2和survivin的mrna和蛋白表達明顯減少(p0.05)。結(jié)論:nar以劑量和時間依賴性促進人胃癌sgc7901細胞的凋亡。nar通過增加sgc7901細胞的促凋亡因子bax和cleaved-caspase-3的mrna和蛋白表達,減少抑制凋亡因子bcl-2和survivin的mrna和蛋白表達而起到促進sgc7901細胞的凋亡作用。第四部分nar對人胃癌sgc7901細胞akt信號通路的影響目的:研究nar對人胃癌sgc7901細胞akt信號通路的影響,進而探討nar是否通過下調(diào)akt信號通路抑制人胃癌sgc7901細胞的增殖、遷移和侵襲并促進細胞凋亡。方法:細胞培養(yǎng)方法同第一部分。首先,分別用濃度為0、20、40和80μmol/l的nar對sgc7901細胞進行處理,時間為24、48和72h;然后收集細胞進行western-blot檢測。檢測指標為:akt和p-akt(磷酸化akt)。然后,將細胞分為四組:1組,不用任何試劑處理;2組,用濃度為50μmol/l的ly294002(akt抑制劑)處理sgc7901細胞2h;3組,濃度為40μmol/l的nar處理sgc7901細胞48h;4組,首先用濃度為50μmol/l的ly294002處理sgc7901細胞2h,然后用濃度為40μmol/l的nar處理sgc7901細胞48h。最后,用mtt檢測細胞的生長率;用劃痕實驗和transwell小室檢測法檢測細胞的遷移和侵襲活性;用流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡情況;用western-blot檢測上述活性相關(guān)因子和akt信號通路的蛋白表達情況,檢測指標為:pcna、bax、bcl-2、mmp2、mmp9、timp1、timp2、akt和p-akt。結(jié)果:1nar對人胃癌sgc7901細胞akt蛋白表達和磷酸化的影響。western-blot研究結(jié)果顯示:nar以劑量和時間依賴方式抑制sgc7901細胞akt的磷酸化,但akt蛋白表達沒有明顯的變化。2nar和akt抑制劑ly294002對人胃癌sgc7901細胞生長的影響。mtt研究結(jié)果顯示:nar和ly294002均能降低sgc7901細胞的生長率(p0.01),并且兩種藥物共同作用于細胞時會進一步降低sgc7901細胞的生長率(p0.01)。3nar和akt抑制劑ly294002對人胃癌sgc7901細胞遷移和侵襲的影響。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示:nar和ly294002均能降低sgc7901細胞的遷移活性(p0.01),并且兩種藥物共同作用于細胞時會進一步降低sgc7901細胞的遷移活性(p0.01)。transwell小室實驗結(jié)果顯示:nar和ly294002均能降低sgc7901細胞的侵襲活性(p0.01),并且兩種藥物共同作用于細胞時會進一步降低sgc7901細胞的侵襲活性(p0.01)。4nar和akt抑制劑ly294002對人胃癌sgc7901細胞凋亡的影響。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:nar和ly294002均能促進sgc7901細胞凋亡(p0.01),并且兩種藥物共同作用于細胞時會進一步促進sgc7901細胞的凋亡(p0.01)。5 Nar和AKT抑制劑LY294002對人胃癌SGC7901細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡相關(guān)因子及AKT蛋白表達和磷酸化的作用。為了進一步確認Nar與AKT抑制劑LY294002聯(lián)合使用對人胃癌SGC7901細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及AKT蛋白表達和磷酸化的作用機制,采用Western-blot方法檢測了PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、AKT和p-AKT的表達變化。Western-blot研究結(jié)果顯示:Nar和LY294002均能增加SGC7901細胞Bax的表達(P0.05),并且兩種藥物共同作用于SGC7901細胞時會進一步增加其表達(P0.05,);Nar和LY294002均能降低SGC7901細胞PCNA、Bcl-2、MMP2、MMP9、p-AKT的表達(P0.05),并且兩種藥物共同作用于細胞時會進一步降低其的表達(P0.05);但是,Nar和LY294002對SGC7901細胞AKT、TIMP1、TIMP2的表達均沒有明顯影響。結(jié)論:Nar可以抑制人胃癌SGC7901細胞AKT的磷酸化,Nar和LY294002聯(lián)合用藥可以協(xié)同作用進一步抑制SGC7901細胞AKT的磷酸化。Nar可能是通過抑制AKT的磷酸化,下調(diào)AKT信號通路,抑制人胃癌SGC7901細胞的增殖、遷移和侵襲并促進細胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙雪峰;魏敬妙;李勇;張志棟;賈楠;;丹參酮ⅡA誘導(dǎo)體外胃癌細胞的自噬[J];中成藥;2014年01期

2 趙雪峰;賈楠;李勇;范立僑;王冬;;丹參酮ⅡA對胃癌細胞遷移和侵襲能力的抑制作用及機制[J];中國癌癥雜志;2013年10期

3 李慶霞;顏聰亞;閆曉路;邢雅軍;隋愛霞;王娟;;乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織FGFR1和Survivin表達臨床意義分析[J];中華腫瘤防治雜志;2013年17期

4 方悅;曹淵;秦蓉;沈慧玲;許文林;;漢防己甲素誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細胞自噬和凋亡的作用及機制[J];山東醫(yī)藥;2013年30期

5 朱燕;楊其昌;劉宏斌;張曉娟;沈屹;劉曼華;;骨橋蛋白、survivin及bcl-2在宮頸病變中的表達及臨床意義[J];腫瘤防治研究;2013年01期

6 王俊霞;王超;呂品田;;氧化苦參堿通過ERK途徑影響SGC7901胃癌細胞增殖的作用機制[J];河北醫(yī)藥;2013年01期

7 郝輝;李娟;李亞輝;;Survivin和Caspase-3蛋白表達與食管鱗癌放療療效的關(guān)系[J];河北醫(yī)藥;2012年15期

8 趙鵬;蔡輝;;姜黃素藥理作用研究進展[J];中醫(yī)藥臨床雜志;2012年04期

9 孫寧;徐玉芳;劉粉霞;;氧化苦參堿對人胃癌MGC-803細胞裸鼠皮下移植瘤形態(tài)學(xué)影響的作用[J];中醫(yī)學(xué)報;2010年06期

10 盧明東;李丕宏;杜曉群;黃和;陳建時;鄭志強;俞耀軍;王飛海;孫維建;;姜黃素對胃癌MGC-803細胞株增殖及其核因子κB表達的影響[J];中國全科醫(yī)學(xué);2010年30期

，

本文編號：2017623