本文選題：肝癌 + 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:Micro RNAs(mi RNAs)在絕大部分癌癥中的表達(dá)都有所失調(diào),例如原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),但失調(diào)的確切機(jī)制尚有待研究。我們課題組在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),與正常肝細(xì)胞相比,肝癌細(xì)胞更易對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(endoplasmic reticulum stress,ERS)產(chǎn)生抵抗,但對于mi RNAs與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡抵抗(也稱應(yīng)激性凋亡抵抗)的相互調(diào)控機(jī)制卻知之甚少。我們利用mi RNAs芯片技術(shù),對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激前后的Hep G2細(xì)胞進(jìn)行mi RNAs表達(dá)譜分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),mi R-663的表達(dá)水平發(fā)生顯著上調(diào)。同時,生物信息學(xué)分析也表明了mi R-663與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和許多腫瘤的增殖、凋亡等生物學(xué)行為有著一定的相關(guān)性。本研究在此基礎(chǔ)上,利用q RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步驗證mi R-663的表達(dá)水平在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后的肝癌細(xì)胞系中的是否會上調(diào),同時通過mi R-663模擬物(mi R-663mimics)和mi R-663阻遏物(mi R-663 inhibitors)來轉(zhuǎn)染肝癌Hep G2細(xì)胞,觀察mi R-663對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下的Hep G2細(xì)胞增殖和凋亡的影響,初步探討mi R-663在肝癌細(xì)胞耐受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。隨后我們又應(yīng)用了靶基因預(yù)測分析軟件,進(jìn)一步探索mi R-663影響肝癌細(xì)胞凋亡的下游靶基因,為闡明肝癌細(xì)胞應(yīng)激性凋亡抵抗的分子機(jī)制帶來新的契機(jī),也將為肝癌藥物治療尋找新的作用靶點奠定理論基礎(chǔ)。方法:1.以3μM的衣霉素(tunicamycin,TM)處理人肝癌Hep G2細(xì)胞株誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,利用mi RNAs芯片技術(shù)檢測未經(jīng)TM處理及TM處理后mi RNAs的表達(dá)變化,對人肝癌Hep G2細(xì)胞株內(nèi)mi RNAs表達(dá)譜分析。2.以3μM的衣霉素(tunicamycin,TM)處理人肝癌細(xì)胞株(Hep G2、Be L7402和SMMC7721細(xì)胞),誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,利用q RT-PCR技術(shù)檢測未經(jīng)TM處理及TM處理24 h后,人肝癌細(xì)胞株內(nèi)mi R-663表達(dá)水平的差異。3.應(yīng)用Lipofectamine RNAi MAX將與mi R-663 mimics,mi R-663 inhibitors轉(zhuǎn)染入Hep G2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后,運用q RT-PCR技術(shù)測定轉(zhuǎn)染后mi R-663表達(dá)水平的變化。4.應(yīng)用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測上調(diào)或下調(diào)mi R-663的表達(dá)水平對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下的Hep G2細(xì)胞增殖的影響。5.應(yīng)用FCM(Flow Cytometry,流式細(xì)胞術(shù)),Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測下調(diào)mi R-663的表達(dá)水平對Hep G2細(xì)胞凋亡率的影響。6.應(yīng)用靶基因預(yù)測軟件分析的mi R-663的靶基因。7.應(yīng)用qRT-PCR和ELISA技術(shù)(酶聯(lián)免疫吸附試驗)檢測上調(diào)或下調(diào)mi R-663的表達(dá)對靶基因TGFB1表達(dá)水平的影響,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激前后TGFB1表達(dá)水平的變化以及轉(zhuǎn)染TGFB1 si RNA后TGFB1表達(dá)水平的變化。8.應(yīng)用FCM(Flow Cytometry,流式細(xì)胞術(shù)),Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測下調(diào)TGFB1的表達(dá)水平對Hep G2細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果:1.Mi RNAs芯片結(jié)果顯示,對衣霉素處理前后的70條mi RNAs進(jìn)行比較分析,mi R-663在衣霉素處理后上調(diào)最明顯,尤其在衣霉素處理24 h后。2.q RT-PCR結(jié)果顯示,衣霉素處理24 h后,mi R-663在Hep G2、Be L7402和SMMC7721細(xì)胞內(nèi)表達(dá)均上調(diào),其表達(dá)水平分別為未處理組的(1.93±0.16)倍、(1.88±0.24)倍和(2.15±0.21)倍。3.qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24 h后,mi R-663 mimics組細(xì)胞內(nèi)mi R-663的表達(dá)水平顯著升高,其相對表達(dá)量約為陰性對照組的(1128.68±74.16)倍,而mi R-663 inhibitors組細(xì)胞內(nèi)mi R-663的表達(dá)水平顯著降低,其相對表達(dá)量約為陰性對照組的(0.27±0.13)倍。4.CCK-8結(jié)果顯示,衣霉素及mi R-663 inhibitors聯(lián)合處理組與衣霉素單獨處理組相比,Hep G2細(xì)胞的增殖率發(fā)生了顯著降低;而衣霉素及mi R-663 mimics聯(lián)合處理組與衣霉素單獨處理組相比,Hep G2細(xì)胞的增殖率出現(xiàn)了顯著上升。5.FCM結(jié)果顯示,衣霉素及mi R-663 inhibitors聯(lián)合處理組的Hep G2細(xì)胞凋亡率顯著高于衣霉素單獨處理組。6.靶基因分析預(yù)測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化生長因子β-1(transforming growth factor beta 1,TGFB1)是mi R-663的靶基因。7.qRT-PCR和ELISA結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-663 mimics使mi R-663表達(dá)水平升高時,TGFB1在m RNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均降低;轉(zhuǎn)染mi R-663 inhibitors使mi R-663表達(dá)水平降低時,TGFB1在m RNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均升高;衣霉素處理Hep G2細(xì)胞24 h后,TGFB1在m RNA和蛋白質(zhì)水平均發(fā)生了顯著下調(diào);轉(zhuǎn)染TGFB1 si RNA后TGFB1在m RNA和蛋白質(zhì)水平均明顯下調(diào)。8.FCM結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染TGFB1 si RNA使TGFB1表達(dá)下調(diào)后,Hep G2細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組。結(jié)論:1.肝癌細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下mi R-663表達(dá)上調(diào)。2.轉(zhuǎn)染mi R-663 mimics和mi R-663 inhibitors能有效地上調(diào)和下調(diào)mi R-663的表達(dá)。3.下調(diào)mi R-663的表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下肝癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。4.肝癌細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下TGFB1表達(dá)下調(diào)。5.上調(diào)mi R-663能抑制TGFB1m RNA和TGFB1蛋白的表達(dá),下調(diào)mi R-663能促進(jìn)TGFB1m RNA和TGFB1蛋白的表達(dá),TGFB1可能是mi R-663的直接靶基因。6.干擾TGFB1 m RNA的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。7.Mi R-663可能通過下調(diào)TGFB1蛋白的表達(dá),抑制肝癌細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Objective: the expression of Micro RNAs (MI RNAs) in most cancers is in disorder, such as primary hepatocellular carcinoma (hepatocellular carcinoma, HCC), but the exact mechanism of the maladjustment remains to be studied. In our previous study, we have found that the hepatoma cells are more susceptible to the endoplasmic reticulum stress induced cell withering compared with normal hepatocytes. Endoplasmic reticulum stress (ERS) produces resistance, but little is known about the mutual regulation mechanism of MI RNAs and endoplasmic reticulum induced apoptosis resistance (also known as stress apoptosis resistance). We use mi RNAs chip technology to carry out mi RNAs expression profiles of Hep G2 cells before and after endoplasmic reticulum stress. At the same time, bioinformatics analysis also showed that MI R-663 and endoplasmic reticulum stress were related to the biological behavior of many tumors and apoptosis. Based on this study, the Q RT-PCR technique was used to further verify the expression of MI R-663 in the liver cancer cell lines after endoplasmic reticulum stress. The effects of MI R-663 analogue (MI R-663mimics) and MI R-663 repressor (MI R-663 inhibitors) on the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells under endoplasmic reticulum stress were observed by using mi R-663mimics and MI R-663 repressor (MI R-663 inhibitors). Then we used the target gene prediction analysis software to further explore the downstream target gene of MI R-663 to affect the apoptosis of hepatoma cells, which will bring new opportunity to elucidate the molecular mechanism of liver cancer cell stress resistance to apoptosis, and lay a foundation for the search for new therapeutic targets for the treatment of liver cancer. Method: 1. to 3 mu M (tunica) Mycin, TM) treated human liver cancer Hep G2 cells to induce endoplasmic reticulum stress, and used mi RNAs chip technique to detect the expression changes of MI RNAs without TM treatment and TM treatment. Endoplasmic reticulum stress, Q RT-PCR technique was used to detect the difference in the expression level of MI R-663 in human hepatoma cells without TM treatment and TM treatment 24 h.3. application Lipofectamine RNAi MAX will be transfected with MI RNAi MAX. .4. application CCK-8 (Cell Counting Kit-8) method to detect the effect of the expression level of MI R-663 on the proliferation of Hep G2 cells under the stress of endoplasmic reticulum.5. FCM (Flow, flow cytometry). The target gene.7. of MI R-663 analysis by gene prediction software applied qRT-PCR and ELISA Technology (ELISA) to detect the effect of up or down expression of MI R-663 on the level of target gene TGFB1 expression, the change of TGFB1 expression level before and after endoplasmic reticulum stress and the change of the expression level after TGFB1 Si RNA. Ytometry, flow cytometry), Annexin V-FITC/PI double staining kit was used to detect the effect of down regulation of TGFB1 expression on the apoptosis rate of Hep G2 cells. Results: the results of 1.Mi RNAs chip showed that the 70 mi RNAs before and after the treatment of ycomycin were compared and analyzed, MI R-663 was up to the most obvious after being treated with ycomycin, especially in the treatment of ycomycin treatment 24. T-PCR results showed that the expression of MI R-663 increased in Hep G2, Be L7402 and SMMC7721 cells after 24 h treatment, and the expression level was (1.93 + 0.16) times, (1.88 + 0.24) times (1.88 + 0.24 times) and (2.15 + 0.21) times.3.qRT-PCR, respectively. The relative expression was about (1128.68 + 74.16) times of the negative control group, while the expression level of MI R-663 in the MI R-663 inhibitors group decreased significantly, and the relative expression amount was about (0.27 + 0.13) times.4.CCK-8 results in the negative control group, which showed that the combined treatment group of ycomycin and Mi R-663 inhibitors was compared with the single treatment group of ycomycin, Hep G. The proliferation rate of 2 cells decreased significantly, while the proliferation rate of Hep G2 cells increased significantly compared with the single treatment group of ycomycin and MI R-663 mimics, which showed that the Hep G2 cell withering rate of the combined treatment group of ycomycin and MI R-663 inhibitors was significantly higher than that of ycomycin alone treated group.6. target group. The result of analysis and prediction showed that transforming growth factor beta -1 (transforming growth factor beta 1, TGFB1) was the result of.7.qRT-PCR and ELISA of the target gene of MI R-663. The expression of TGFB1 at the level of M RNA and protein increased. After 24 h of Hep G2 cells treated with mycophencin, TGFB1 decreased significantly at the RNA and protein levels of M. The expression of MI R-663 in 1. hepatoma cells under endoplasmic reticulum stress up regulation of.2. transfected mi R-663 mimics and MI R-663 inhibitors can effectively regulate the expression of MI R-663, the expression of.3. down regulation can promote the apoptosis of hepatoma cells under the stress of endoplasmic reticulum and inhibit the proliferation of hepatoma cells The down regulation of TGFB1 expression under the stress of endoplasmic reticulum up regulation of.5. up regulation of MI R-663 can inhibit the expression of TGFB1m RNA and TGFB1 protein, and the downregulation of MI R-663 can promote TGFB1m RNA and the expression of TGFB1 protein. The expression of white inhibits the apoptosis of hepatoma cells.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2016262