肺癌是所有癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。事實(shí)上,單獨(dú)的肺癌死亡超過了接下來三種最普遍的癌癥死亡(結(jié)腸癌,乳腺癌和前列腺癌)的總和。肺癌的預(yù)后不良部分是由于在早期疾病進(jìn)展期間缺乏任何明顯癥狀的晚期診斷。此外,在NSCLC中鑒定的包括突變,擴(kuò)增,缺失和融合在內(nèi)的多種基因改變加重了信號(hào)通路和生理活性的異常。因此,探究治療肺癌的有效靶點(diǎn)迫在眉睫。近幾十年的研究表明有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)許多不同的信號(hào),從而產(chǎn)生了廣泛的細(xì)胞反應(yīng),包括細(xì)胞增殖,分化,存活,遷移,神經(jīng)元功能和免疫應(yīng)答。Raf激酶(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)是逆轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因,它調(diào)控細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)和凋亡等諸多生命過程,Raf-MEK-ERK通路是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的一條主干通路,這條通路的異常調(diào)控是細(xì)胞癌變的主要原因之一。RAF激酶的生理調(diào)節(jié)是復(fù)雜的,并涉及幾個(gè)步驟,包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用,磷酸化,去磷酸化和構(gòu)象變化。且C-RAF作為MAPK通路中的主要樞紐蛋白,其功能及結(jié)合蛋白對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。KAP1是人源TRIM基因家族的成員,并且與其它三種TRIM蛋白(TIF1α,TIF1γ和TIF1δ)高度相關(guān)。KAP1是正常發(fā)育和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物;缺乏KAP1的小鼠在預(yù)處理前死亡,而在成年前腦中特異性缺失KAP1的小鼠表現(xiàn)出更高水平的焦慮和應(yīng)激誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)及記憶的改變。KAP1還參與維持多能性,是小鼠胚胎干細(xì)胞的終末分化所必需的,并且已經(jīng)與促進(jìn)和抑制不同成人細(xì)胞類型的分化相關(guān)。KAP1在正常和腫瘤細(xì)胞的增殖和分化中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)C-RAF可以特意結(jié)合KAP1;實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了臨床肺癌組織及鄰近正常肺組織中KAP1的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KAP1在肺癌組織中高表達(dá)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,利用CRISP/cas9技術(shù)成功的在肺癌A549細(xì)胞株中成功敲除KAP1,并進(jìn)行了 rescue實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后,細(xì)胞增殖率顯著降低;在化療藥物敏感中發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后A549細(xì)胞對(duì)順鉑及5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性顯著增加,且發(fā)現(xiàn)低濃度的5-FU基本不會(huì)促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡,敲除KAP1后細(xì)胞明顯發(fā)生凋亡;通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生A549細(xì)胞、rescue細(xì)胞及敲除KAP1細(xì)胞確定了敲除KAP1后,ERK會(huì)被異常激活;劃痕及transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后細(xì)胞遷移受到顯著抑制;成球?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)敲除KAP1成球率顯著降低,且western blot顯示細(xì)胞干性標(biāo)志物明顯降低;軟瓊脂克隆形成發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后克隆形成數(shù)目及大小顯著減少;血管形成發(fā)現(xiàn)敲降KAP1后,血管形成能力顯著下降;EMT轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后,細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力明顯減弱;流失細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞周期受到顯著抑制;移植瘤實(shí)驗(yàn)表明敲除KAP1后裸鼠移植瘤的體積及重量明顯減小;裸鼠體重明顯增加;AKO組移植瘤的增殖速度明顯慢于A549組。移植瘤HE染色顯示:A549組較AKO組相比,腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,胞核肥大、呈藍(lán)色深染、核分裂相多見,偶見腺腔樣結(jié)構(gòu)。本研究表明KAP1在肺癌細(xì)胞A549中具有重要作用,敲除后細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、細(xì)胞干性、侵襲遷移能力、血管形成能力及細(xì)胞周期受到抑制,且會(huì)異常磷酸化ERK,提高A549細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。目前對(duì)于C-RAF及KAP1在肺癌發(fā)生發(fā)展的作用還很少,本研究對(duì)于它們?cè)诜伟┌l(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行了初步探索,為臨床治療肺癌提供理論依據(jù)和新的作用靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2