本文選題：分子對接 + smad3�。� 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分對高三尖杉酯堿作用靶蛋白的虛擬篩選目的:篩選出高三尖杉酯堿(HHT)可能的作用靶蛋白。方法:采用虛擬篩選中分子對接的方法,應(yīng)用Autodock、MGLtools、Python等軟件,以高三尖杉酯堿為配體,以文獻報道過跟HHT作用相關(guān)信號通路的關(guān)鍵信號分子為受體,進行分子對接,根據(jù)對接后構(gòu)象的自由能進行篩選。結(jié)果:(1)共將HHT與30個蛋白分子進行對接,其中對接構(gòu)象能量最低的為smad3.(2)對分子對接以后的構(gòu)象研究顯示,HHT可能與smad3MH2結(jié)構(gòu)域C端相結(jié)合。結(jié)論:smad3可能為HHT作用的靶分子。第二部分:高三尖杉酯堿對AML細胞株細胞靶分子smad3和TGF-β的作用研究目的:驗證第一部分的結(jié)論,探索HHT與smad3的關(guān)系,HHT與TGF-β信號通路的關(guān)系。方法:采用MTT法檢測HHT對AML細胞株的增殖抑制作用,以及轉(zhuǎn)染smad3-shRNA前后HHT對U937細胞的作用;采用Western Blot檢測HHT作用后smad3的改變、細胞核內(nèi)smad2/3和smad4的改變、周期相關(guān)蛋白的改變及轉(zhuǎn)染后目的蛋白的改變;采用免疫熒光的方法檢測HHT作用后,smad4蛋白細胞內(nèi)定位的改變;流式細胞術(shù)檢測HHT作用后,細胞凋亡和周期情況;采用慢病毒轉(zhuǎn)染smad3-shRNA,降低U937內(nèi)smad3蛋白的表達;集落形成實驗檢測HHT對轉(zhuǎn)染前后細胞集落形成能力的影響。統(tǒng)計學(xué)分析,單一變量兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。以p0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:(1)HHT可促進smad3 ser423/425位的磷酸化。(2)HHT可促進smad4進入細胞核,使核蛋白中smad2/3和smad4含量增加。(3)HHT作用于U937細胞后,細胞凋亡無明顯改變,細胞周期出現(xiàn)G1期阻滯。并有c-myc、p15、CDK4/6等蛋白的改變。(4)使用慢病毒載體將smad3-shRNA轉(zhuǎn)染進入U937細胞后,smad3蛋白量減少,HHT對轉(zhuǎn)染后的U937細胞24h的IC50值增加。G1期阻滯減弱。轉(zhuǎn)染后,在相同HHT濃度下,smad3-shRNA-U937細胞能比U937形成更多的集落。(5)在U937細胞中,HHT通過周期阻滯而非誘導(dǎo)凋亡來抑制細胞增殖,而在另一種AML細胞株KG-1中,HHT通過誘導(dǎo)凋亡來抑制細胞增殖,對周期無明顯影響。結(jié)論:(1)HHT能通過ser423/425位點磷酸化激活smad3。(2)HHT能通過激活smad3激活TGF-β信號通路。(3)HHT對細胞周期的阻滯及引起相關(guān)蛋白的改變符合TGF-β信號通路激活的表現(xiàn)。(4)慢病毒轉(zhuǎn)染降低U937細胞內(nèi)smad3表達后,U937細胞對HHT敏感性減弱,周期阻滯減弱。轉(zhuǎn)染后的細胞在集落形成方面對HHT敏感性也減弱。(5)HHT對不同AML細胞作用具有異質(zhì)性,與TGF-β的異質(zhì)性相符合。(6)Smad3和TGF-β信號通路為HHT潛在的靶蛋白和靶向通路.第三部分初發(fā)急性髓系白血病患者smad3表達與預(yù)后關(guān)系的探討目的:檢測臨床初發(fā)AMIL標(biāo)本中,smad3的mRNA表達水平,探討smad3的表達水平與患者臨床預(yù)后及其他臨床指標(biāo)之間的關(guān)系。方法:收集臨床初發(fā)AML患者骨髓標(biāo)本,用人淋巴細胞分離液分離收集患者單個核細胞,Trizol裂解細胞,提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄。用實時熒光定量PCR的方法檢測smad3基因的表達。用普通PCR和Sanger測序法檢測基因突變,用Kaplan-meier法分析患者生存情況,Cox回歸模型探討smad3及其他各因素與患者預(yù)后的關(guān)系。認為p0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:(1)smad3高表達組與低表達組相比,患者具有更好的OS和EFS(p值均小于 0.05)(2)Cox回歸模型中,smad3表達與患者的OS密切相關(guān)。結(jié)論:smad3為初發(fā)AML患者OS的獨立預(yù)后因素。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of HHT on the expression of smad3 and TGF - 尾 in AML cell line . The results showed that ( 1 ) HHT could promote the phosphorylation of smad3 ser423 / 425 . ( 4 ) HHT can inhibit cell proliferation by activating smad3 - shRNA . ( 4 ) HHT can inhibit cell proliferation by activating smad3 . ( 2 ) HHT can inhibit cell proliferation by activating smad3 . ( 6 ) Smad3 and TGF - 尾 signaling pathway is the potential target protein and target pathway of HHT . The relationship between the expression level of smad3 and prognosis in patients with acute myeloid leukemia ( AML ) is investigated by means of real - time PCR and Sanger sequencing .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71

【參考文獻】

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1 沈建平;楊宏;倪萬茂;錢文斌;;高三尖杉酯堿對人急性髓系白血病干細胞的殺傷作用[J];浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年05期

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本文編號：2013067