本文選題：結(jié)腸癌 + miR-93�。� 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：結(jié)腸癌是我國(guó)高發(fā)高危的常見惡性腫瘤之一,高居我國(guó)癌癥致死率第三位。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌患者的數(shù)量逐年增加并呈加速趨勢(shì)。尤其是近年來(lái)物質(zhì)生活條件的改善,同時(shí)受到人口老齡化和環(huán)境問(wèn)題等負(fù)面因素的影響,導(dǎo)致我國(guó)的結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年升高,已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的關(guān)注重點(diǎn)。盡管隨著各項(xiàng)研究的深入和技術(shù)的進(jìn)步,結(jié)直腸癌的早期診斷和治療手段都有了顯著進(jìn)步,包括內(nèi)窺鏡技術(shù)和放化療藥物的開發(fā),但是腫瘤的診斷和治療仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。主要困境在于其發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍未完全明確,臨床的主要治療方案是根治手術(shù)聯(lián)合化學(xué)治療,但是目前局部腫瘤5年的生存率仍不理想,同時(shí)超過(guò)50%的患者在確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)不同程度和不同器官的轉(zhuǎn)移,術(shù)后復(fù)發(fā)率極高,是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者死亡的重要原因。由此可見,深入探索結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的調(diào)控表達(dá)機(jī)制,對(duì)于發(fā)展新的治療策略和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)具有極為重要的意義。miRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小RNA,被發(fā)現(xiàn)具有廣泛而重要的生理功能。目前研究已經(jīng)證實(shí),miRNA的作用主要是通過(guò)與靶基因的3’段結(jié)合,從而影響mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯,進(jìn)而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行特異性調(diào)控。值得注意的是miRNA的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了極其重要的作用。針對(duì)其與癌細(xì)胞的功能關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),miRNA的表達(dá)能夠參與調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)和功能維持、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡、遷移侵襲,從而對(duì)個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育、維持機(jī)體功能等方面產(chǎn)生重要的調(diào)控作用。異常表達(dá)的miRNA是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一,值得注意的是,不同miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用及機(jī)制有其特異性。此外,miRNA在癌細(xì)胞中的上下游的調(diào)控機(jī)制往往更為復(fù)雜。為了明確miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制,在對(duì)miRNA的作用研究中,需要對(duì)其調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)和靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究。miRNA-93作為最近被鑒定并證實(shí)的新miRNA,其在多種惡性腫瘤中起著重要的調(diào)控作用。在多種腫瘤中均證實(shí)了miRNA-93具有重要的調(diào)節(jié)作用。例如,有研究者報(bào)道,miR-93在結(jié)腸癌患者體內(nèi)的表達(dá)出現(xiàn)異常升高,更有意義的是,miR-93表達(dá)水平與結(jié)腸癌各階段狀態(tài)及預(yù)后均存在明確相關(guān)性。此外,miR-93的異常升高與結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移狀況有關(guān),通過(guò)特異性抑制劑來(lái)下調(diào)miR-93的表達(dá)能夠增加化療藥物對(duì)動(dòng)物模型的敏感性。雖然目前研究能夠表明miR-93與結(jié)腸癌的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān),但是對(duì)于其調(diào)控機(jī)制尚不明確。抑癌基因PTEN,英文全稱為phosphatase and tensin homolog that deleted on chromosome ten,是定位于染色體10q23.3的人磷酸酶及張力蛋白同源基因。PTEN在研究發(fā)現(xiàn)后,作為具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因,迅速成為抗癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)靶蛋白。PTEN蛋白作為PTP(protein tyrosine phosphatases)蛋白家族的重要成員,是具有腫瘤抑制作用的核心蛋白之一,其主要作用是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂周期,抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外研究指出,PTEN蛋白在調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)移、新血管生成等惡性腫瘤生物學(xué)行為方面具有重要作用。在臨床上已經(jīng)證實(shí)PTEN蛋白的表達(dá)水平具有作為腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)的潛在作用,由此可見進(jìn)一步闡明PTEN及其調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制對(duì)腫瘤的診斷預(yù)后和藥物靶點(diǎn)研究具有重要價(jià)值。為進(jìn)一步探索miR-93在結(jié)腸癌中的作用地位和調(diào)控機(jī)制,首先收集并檢測(cè)在臨床結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中miR-93的表達(dá)改變,并在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-93的抑制劑或過(guò)表達(dá)載體,對(duì)miR-93對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞多種生物學(xué)行為的作用進(jìn)行明確;然后通過(guò)miRNA靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-93的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。綜上所述,我們的研究結(jié)果將有望為結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供新的思路和藥物靶點(diǎn),并為為結(jié)腸癌的早期診斷和臨床治療提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。1.材料與方法:臨床樣本收集來(lái)自2012年9月-2015年9月期間在吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部進(jìn)行手術(shù)切除的臨床樣本結(jié)腸癌組織25例,同時(shí)收集癌旁正常組織23例作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。通過(guò)Real-time PCR方法檢測(cè)miR-93在結(jié)腸癌組織和癌旁組織、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞中的表達(dá)情況;采用原位雜交檢測(cè)結(jié)腸癌組織中miR-93的表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞株中的表達(dá)情況,采用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞作為研究對(duì)象。采用LNA anti-miR-93 inhibitor轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞抑制miR-93的表達(dá),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的改變,采用細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。在明確miR-93在結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用后,采用miRNA靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè)的生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-93的可能的下游靶點(diǎn)可能為PTEN,然后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因方法對(duì)上述預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。運(yùn)用miR-93 mimics轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞增強(qiáng)miR-93的表達(dá),運(yùn)用LNA anti-miR-93 inhibitor轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞抑制miR-93的表達(dá),在上述細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)改變,從而對(duì)miR-93調(diào)控人結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的機(jī)制進(jìn)行確認(rèn)。2.結(jié)果:2.1 Real-time PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-93在臨床結(jié)腸癌組織樣本及人結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)均出現(xiàn)顯著上調(diào)。與正常結(jié)腸組織相比,miR-93的在腫瘤組織中的表達(dá)顯著升高。以相應(yīng)的癌旁組織作為對(duì)照,90.5%(22/25)的結(jié)腸癌組織中miR-93表達(dá)水平顯著增加(p0.01),結(jié)腸癌組的平均表達(dá)為2.09倍(與對(duì)照組相比);原位雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-93表達(dá)增高。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-93的表達(dá)異常,我們對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HCT116中miR-93表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,SW480細(xì)胞中miR-93表達(dá)水平為正常組織的3.08倍(與癌旁組織相比,p0.01);HCT116細(xì)胞中miR-93的表達(dá)水平為正常組織的3.79倍(與癌旁組織相比,p0.01);由此可見在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們選擇HCT116細(xì)胞株用于miR-93的功能和機(jī)制研究。2.2抑制miR-93的表達(dá)能夠影響結(jié)腸癌細(xì)胞的活力和克隆增殖,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。為了探索miR-93的異常高表達(dá)在結(jié)腸癌中的地位和作用,我們應(yīng)用鎖核酸反義miR-93轉(zhuǎn)染來(lái)抑制HCT116細(xì)胞中的miR-93的表達(dá)。隨后通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力改變,結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)染24 h后,HCT116細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降為0.64±0.07,并隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加,細(xì)胞活力繼續(xù)呈下降趨勢(shì),與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比(p0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表示miR-93的異常表達(dá)升高與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。軟瓊脂的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)miR-93的表達(dá)被抑制后,細(xì)胞克隆的形成能力也受到了顯著抑制。在上述miR-93表達(dá)下調(diào)的HCT116細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,我們檢測(cè)了miR-93表達(dá)下調(diào)對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染24 h后,空白對(duì)照組(Blank)細(xì)胞的凋亡比例為8.7±1.5%,陰性對(duì)照組(LNA control)的細(xì)胞凋亡比例為12.6±1.9%,LNA anti-miR-93 inhibitor轉(zhuǎn)染后對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡顯著增加至25.7±2.9%,與陰性對(duì)照組相比(p0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.3 PTEN是miR-93調(diào)控的下游靶蛋白。采用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件,我們篩選得到PTEN是miR-93的潛在靶蛋白之一。為驗(yàn)證miR-93對(duì)PTEN的調(diào)控作用,構(gòu)建包含PTEN'UTR序列(野生型-PTEN)或刪除miR-93結(jié)合位點(diǎn)(突變型-PTEN)的序列熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,然后與miR-93擬似物共轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)野生型PTEN的熒光素酶活性與對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞相比,可見顯著降低;但是轉(zhuǎn)染突變型PTEN質(zhì)粒的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性與對(duì)照組相比未發(fā)現(xiàn)顯著差異。為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,我們采用western blot結(jié)合轉(zhuǎn)染LNA anti-miR-93 inhibitor或者miR-93 mimics,檢測(cè)結(jié)果證實(shí),miR-93表達(dá)上調(diào)后,能夠下調(diào)PTEN在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中的表達(dá),而miR-93表達(dá)下調(diào)后,PTEN在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中的表達(dá)隨之增強(qiáng)。2.4 miR-93調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路。為了研究miR-93在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),我們檢測(cè)了miR-93對(duì)關(guān)鍵信號(hào)通路PI3K-Akt的影響,我們通過(guò)轉(zhuǎn)染LNA miR-93 inhibitor抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞內(nèi)miR-93表達(dá),隨后對(duì)PI3K-Akt通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的mRNA水平進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。miR-93表達(dá)下調(diào)后,PI3K,Akt和mTOR的mRNA水平均出現(xiàn)顯著下降,其中PI3K mRNA下降為0.54±0.04(與對(duì)照組相比,p0.01),Akt mRNA下降為0.51±0.05(與對(duì)照組相比,p0.01),mTOR mRNA下降為0.72±0.06(與對(duì)照組相比,p0.05)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-93在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中PI3K-Akt通路的影響,我們通過(guò)轉(zhuǎn)染LNA miR-93 inhibitor抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞內(nèi)miR-93表達(dá),隨后對(duì)PI3K-Akt通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的蛋白水平進(jìn)行western blot檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致,miR-93表達(dá)下調(diào)后,PI3K,Akt和mTOR的蛋白水平均出現(xiàn)顯著下降,其中PI3K蛋白下降為0.49±0.05(與對(duì)照組相比,p0.01),Akt蛋白下降為0.53±0.05(與對(duì)照組相比,p0.01),mTOR蛋白下降為0.75±0.08(與對(duì)照組相比,p0.05)。3.結(jié)論:3.1 miR-93在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系中存在顯著的高表達(dá)。3.2 miR-93表達(dá)受到抑制后,人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞活力下降,增殖能力受到明顯抑制,同時(shí)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡比例顯著增加,這些結(jié)果暗示miR-93具有作為基因治療的潛在價(jià)值。3.3生物信息學(xué)方法結(jié)合雙熒光素酶方法,證實(shí)PTEN為miR-93調(diào)控的靶蛋白,PTEN的表達(dá)受到miR-93的抑制。3.4 miR-93表達(dá)抑制后,HCT116細(xì)胞中PI3K,Akt和mTOR的表達(dá)顯著降低,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-93可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。
[Abstract]:miRNA - 93 has been recently identified as one of the key regulatory factors in the development of cancer . It is important to study the role and mechanism of miRNA in the development of cancer . The expression of miR - 93 in colon cancer tissues and adjacent tissues , human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 cells were determined by means of real - time PCR . In order to investigate the effect of miR - 93 on the expression of miR - 93 in colon cancer cells , the expression of miR - 93 was significantly decreased compared with control group ( P 0.01 ) . The expression of miR - 93 in human colon cancer HCT116 cells was detected by transfection of LNA miR - 93 inhibitor . The mRNA level of the key protein in human colon cancer HCT116 was detected by real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . In order to further verify the effect of miR - 93 in colon cancer cell HCT116 , the expression of miR - 93 in human colon cancer HCT116 cells was inhibited by transfection of LNA miR - 93 inhibitor .
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.35

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8 宋e，

本文編號(hào)：2003795