本文選題：結(jié)腸癌 + miR-93�。� 參考：《吉林大學》2017年博士論文

【摘要】：結(jié)腸癌是我國高發(fā)高危的常見惡性腫瘤之一,高居我國癌癥致死率第三位。流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌患者的數(shù)量逐年增加并呈加速趨勢。尤其是近年來物質(zhì)生活條件的改善,同時受到人口老齡化和環(huán)境問題等負面因素的影響,導致我國的結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年升高,已經(jīng)成為國內(nèi)醫(yī)學研究領域的關注重點。盡管隨著各項研究的深入和技術的進步,結(jié)直腸癌的早期診斷和治療手段都有了顯著進步,包括內(nèi)窺鏡技術和放化療藥物的開發(fā),但是腫瘤的診斷和治療仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。主要困境在于其發(fā)生發(fā)展機制仍未完全明確,臨床的主要治療方案是根治手術聯(lián)合化學治療,但是目前局部腫瘤5年的生存率仍不理想,同時超過50%的患者在確診時已經(jīng)出現(xiàn)不同程度和不同器官的轉(zhuǎn)移,術后復發(fā)率極高,是導致結(jié)腸癌患者死亡的重要原因。由此可見,深入探索結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展相關基因的調(diào)控表達機制,對于發(fā)展新的治療策略和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點具有極為重要的意義。miRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類長度為19-24個核苷酸的單鏈非編碼小RNA,被發(fā)現(xiàn)具有廣泛而重要的生理功能。目前研究已經(jīng)證實,miRNA的作用主要是通過與靶基因的3’段結(jié)合,從而影響mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯,進而對靶基因的表達進行特異性調(diào)控。值得注意的是miRNA的異常表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了極其重要的作用。針對其與癌細胞的功能關系研究發(fā)現(xiàn),miRNA的表達能夠參與調(diào)控細胞狀態(tài)和功能維持、調(diào)節(jié)細胞增殖凋亡、遷移侵襲,從而對個體生長發(fā)育、維持機體功能等方面產(chǎn)生重要的調(diào)控作用。異常表達的miRNA是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關鍵調(diào)節(jié)因子之一,值得注意的是,不同miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用及機制有其特異性。此外,miRNA在癌細胞中的上下游的調(diào)控機制往往更為復雜。為了明確miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和機制,在對miRNA的作用研究中,需要對其調(diào)控的基因網(wǎng)絡和靶點蛋白進行關聯(lián)性研究。miRNA-93作為最近被鑒定并證實的新miRNA,其在多種惡性腫瘤中起著重要的調(diào)控作用。在多種腫瘤中均證實了miRNA-93具有重要的調(diào)節(jié)作用。例如,有研究者報道,miR-93在結(jié)腸癌患者體內(nèi)的表達出現(xiàn)異常升高,更有意義的是,miR-93表達水平與結(jié)腸癌各階段狀態(tài)及預后均存在明確相關性。此外,miR-93的異常升高與結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移狀況有關,通過特異性抑制劑來下調(diào)miR-93的表達能夠增加化療藥物對動物模型的敏感性。雖然目前研究能夠表明miR-93與結(jié)腸癌的發(fā)生和預后密切相關,但是對于其調(diào)控機制尚不明確。抑癌基因PTEN,英文全稱為phosphatase and tensin homolog that deleted on chromosome ten,是定位于染色體10q23.3的人磷酸酶及張力蛋白同源基因。PTEN在研究發(fā)現(xiàn)后,作為具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因,迅速成為抗癌研究領域的熱點靶蛋白。PTEN蛋白作為PTP(protein tyrosine phosphatases)蛋白家族的重要成員,是具有腫瘤抑制作用的核心蛋白之一,其主要作用是通過調(diào)控細胞分裂周期,抑制細胞增殖和促進細胞凋亡來實現(xiàn)。此外研究指出,PTEN蛋白在調(diào)控細胞轉(zhuǎn)移、新血管生成等惡性腫瘤生物學行為方面具有重要作用。在臨床上已經(jīng)證實PTEN蛋白的表達水平具有作為腫瘤預后評價指標的潛在作用,由此可見進一步闡明PTEN及其調(diào)控的網(wǎng)絡機制對腫瘤的診斷預后和藥物靶點研究具有重要價值。為進一步探索miR-93在結(jié)腸癌中的作用地位和調(diào)控機制,首先收集并檢測在臨床結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中miR-93的表達改變,并在人結(jié)腸癌細胞系中進行驗證。在此基礎上,通過轉(zhuǎn)染miR-93的抑制劑或過表達載體,對miR-93對結(jié)腸癌細胞多種生物學行為的作用進行明確;然后通過miRNA靶點基因預測軟件對miR-93的下游靶基因進行預測并進行實驗驗證。綜上所述,我們的研究結(jié)果將有望為結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的機制提供新的思路和藥物靶點,并為為結(jié)腸癌的早期診斷和臨床治療提供有價值的實驗證據(jù)。1.材料與方法:臨床樣本收集來自2012年9月-2015年9月期間在吉林大學第一醫(yī)院二部進行手術切除的臨床樣本結(jié)腸癌組織25例,同時收集癌旁正常組織23例作為實驗對照組。通過Real-time PCR方法檢測miR-93在結(jié)腸癌組織和癌旁組織、人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞和SW480細胞中的表達情況;采用原位雜交檢測結(jié)腸癌組織中miR-93的表達情況。根據(jù)細胞株中的表達情況,采用人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞作為研究對象。采用LNA anti-miR-93 inhibitor轉(zhuǎn)染HCT116細胞抑制miR-93的表達,同時設置空白對照組和陰性對照組,采用MTT法檢測細胞活力的改變,采用細胞克隆實驗檢測細胞增殖能力,采用流式細胞術檢測細胞凋亡狀態(tài)。在明確miR-93在結(jié)腸癌細胞生物學行為中的作用后,采用miRNA靶點基因預測的生物信息學軟件預測miR-93的可能的下游靶點可能為PTEN,然后通過雙熒光素酶報告基因方法對上述預測結(jié)果進行進行實驗驗證。運用miR-93 mimics轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞增強miR-93的表達,運用LNA anti-miR-93 inhibitor轉(zhuǎn)染HCT116細胞抑制miR-93的表達,在上述細胞模型的基礎上,檢測PI3K/Akt信號通路表達改變,從而對miR-93調(diào)控人結(jié)腸癌細胞的生物學行為的機制進行確認。2.結(jié)果:2.1 Real-time PCR的檢測結(jié)果顯示,miR-93在臨床結(jié)腸癌組織樣本及人結(jié)腸癌細胞系中的表達均出現(xiàn)顯著上調(diào)。與正常結(jié)腸組織相比,miR-93的在腫瘤組織中的表達顯著升高。以相應的癌旁組織作為對照,90.5%(22/25)的結(jié)腸癌組織中miR-93表達水平顯著增加(p0.01),結(jié)腸癌組的平均表達為2.09倍(與對照組相比);原位雜交實驗進一步證實在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-93表達增高。為進一步驗證miR-93的表達異常,我們對人結(jié)腸癌細胞SW480和HCT116中miR-93表達水平進行檢測,結(jié)果顯示,SW480細胞中miR-93表達水平為正常組織的3.08倍(與癌旁組織相比,p0.01);HCT116細胞中miR-93的表達水平為正常組織的3.79倍(與癌旁組織相比,p0.01);由此可見在后續(xù)實驗中,我們選擇HCT116細胞株用于miR-93的功能和機制研究。2.2抑制miR-93的表達能夠影響結(jié)腸癌細胞的活力和克隆增殖,促進結(jié)腸癌細胞凋亡。為了探索miR-93的異常高表達在結(jié)腸癌中的地位和作用,我們應用鎖核酸反義miR-93轉(zhuǎn)染來抑制HCT116細胞中的miR-93的表達。隨后通過MTT實驗檢測細胞活力改變,結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)染24 h后,HCT116細胞活力出現(xiàn)顯著下降為0.64±0.07,并隨著轉(zhuǎn)染時間的增加,細胞活力繼續(xù)呈下降趨勢,與空白對照組和陰性對照組相比(p0.01),具有統(tǒng)計學差異。這表示miR-93的異常表達升高與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關。軟瓊脂的實驗結(jié)果表明,結(jié)腸癌細胞內(nèi)miR-93的表達被抑制后,細胞克隆的形成能力也受到了顯著抑制。在上述miR-93表達下調(diào)的HCT116細胞模型的基礎上,我們檢測了miR-93表達下調(diào)對HCT116細胞凋亡的影響,流式細胞術檢測結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染24 h后,空白對照組(Blank)細胞的凋亡比例為8.7±1.5%,陰性對照組(LNA control)的細胞凋亡比例為12.6±1.9%,LNA anti-miR-93 inhibitor轉(zhuǎn)染后對HCT116細胞凋亡顯著增加至25.7±2.9%,與陰性對照組相比(p0.01),具有統(tǒng)計學差異。2.3 PTEN是miR-93調(diào)控的下游靶蛋白。采用miRNA靶基因預測軟件,我們篩選得到PTEN是miR-93的潛在靶蛋白之一。為驗證miR-93對PTEN的調(diào)控作用,構建包含PTEN'UTR序列(野生型-PTEN)或刪除miR-93結(jié)合位點(突變型-PTEN)的序列熒光素酶報告質(zhì)粒,然后與miR-93擬似物共轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞,檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞內(nèi)野生型PTEN的熒光素酶活性與對照miRNA轉(zhuǎn)染的HCT116細胞相比,可見顯著降低;但是轉(zhuǎn)染突變型PTEN質(zhì)粒的結(jié)腸癌HCT116細胞內(nèi)熒光素酶活性與對照組相比未發(fā)現(xiàn)顯著差異。為了進一步驗證預測結(jié)果,我們采用western blot結(jié)合轉(zhuǎn)染LNA anti-miR-93 inhibitor或者miR-93 mimics,檢測結(jié)果證實,miR-93表達上調(diào)后,能夠下調(diào)PTEN在結(jié)腸癌細胞HCT116中的表達,而miR-93表達下調(diào)后,PTEN在結(jié)腸癌細胞HCT116中的表達隨之增強。2.4 miR-93調(diào)控PI3K/Akt信號通路。為了研究miR-93在結(jié)腸癌細胞HCT116中基因調(diào)控網(wǎng)絡,我們檢測了miR-93對關鍵信號通路PI3K-Akt的影響,我們通過轉(zhuǎn)染LNA miR-93 inhibitor抑制結(jié)腸癌HCT116細胞內(nèi)miR-93表達,隨后對PI3K-Akt通路關鍵蛋白表達的mRNA水平進行實時定量PCR檢測。miR-93表達下調(diào)后,PI3K,Akt和mTOR的mRNA水平均出現(xiàn)顯著下降,其中PI3K mRNA下降為0.54±0.04(與對照組相比,p0.01),Akt mRNA下降為0.51±0.05(與對照組相比,p0.01),mTOR mRNA下降為0.72±0.06(與對照組相比,p0.05)。為了進一步驗證miR-93在結(jié)腸癌細胞HCT116中PI3K-Akt通路的影響,我們通過轉(zhuǎn)染LNA miR-93 inhibitor抑制結(jié)腸癌HCT116細胞內(nèi)miR-93表達,隨后對PI3K-Akt通路關鍵蛋白表達的蛋白水平進行western blot檢測。檢測結(jié)果與mRNA檢測結(jié)果一致,miR-93表達下調(diào)后,PI3K,Akt和mTOR的蛋白水平均出現(xiàn)顯著下降,其中PI3K蛋白下降為0.49±0.05(與對照組相比,p0.01),Akt蛋白下降為0.53±0.05(與對照組相比,p0.01),mTOR蛋白下降為0.75±0.08(與對照組相比,p0.05)。3.結(jié)論:3.1 miR-93在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細胞系中存在顯著的高表達。3.2 miR-93表達受到抑制后,人結(jié)腸癌HCT116細胞活力下降,增殖能力受到明顯抑制,同時結(jié)腸癌細胞的凋亡比例顯著增加,這些結(jié)果暗示miR-93具有作為基因治療的潛在價值。3.3生物信息學方法結(jié)合雙熒光素酶方法,證實PTEN為miR-93調(diào)控的靶蛋白,PTEN的表達受到miR-93的抑制。3.4 miR-93表達抑制后,HCT116細胞中PI3K,Akt和mTOR的表達顯著降低,我們的實驗結(jié)果表明miR-93可能通過PI3K/Akt信號通路參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的過程。
[Abstract]:miRNA - 93 has been recently identified as one of the key regulatory factors in the development of cancer . It is important to study the role and mechanism of miRNA in the development of cancer . The expression of miR - 93 in colon cancer tissues and adjacent tissues , human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 cells were determined by means of real - time PCR . In order to investigate the effect of miR - 93 on the expression of miR - 93 in colon cancer cells , the expression of miR - 93 was significantly decreased compared with control group ( P 0.01 ) . The expression of miR - 93 in human colon cancer HCT116 cells was detected by transfection of LNA miR - 93 inhibitor . The mRNA level of the key protein in human colon cancer HCT116 was detected by real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . In order to further verify the effect of miR - 93 in colon cancer cell HCT116 , the expression of miR - 93 in human colon cancer HCT116 cells was inhibited by transfection of LNA miR - 93 inhibitor .
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.35

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本文編號：2003795