發(fā)布時間：2018-06-05 22:43

  本文選題：髓系白血病 + HGF��； 參考：《福建醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：目的:研究HGF在髓系白血病細胞中的表達及其作用。方法:1.收集91例急性髓系白血病初診未治療患者、41例急性髓系白血病緩解患者、32例正常人的骨髓標本,利用實時定量RT-PCR(q RT-PCR)及Western Blot方法分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測髓系白血病細胞中HGF及其相關(guān)基因c-Met、HGFA、HAI-1、HAI-2、Matriptase m RNA與蛋白表達水平;比較上述基因在人急性髓系白血病患者初診未治療組、緩解組及健康對照組中的表達情況;分析上述基因的表達情況與人急性髓系白血病初診未治療患者中部分臨床資料的相關(guān)性;2.利用慢病毒載體表達短發(fā)卡RNA(sh RNA)在髓系白血病細胞Kasumi-1、HL60中下調(diào)HGF表達;q RT-PCR及Western Blot驗證HGF sh RNA的沉默效果;3.觀察HGF基因沉默后細胞生物學行為變化:CCK-8法檢測細胞增殖能力;克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力;流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞周期和凋亡的變化;DAPI熒光染色法觀察細胞凋亡形態(tài);FN粘附實驗檢測細胞粘附能力;Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力;Western blot檢測細胞增殖凋亡、周期相關(guān)蛋白表達水平及HGF下游PI3K-AKT、MAPK/ERK等信號通路改變。結(jié)果:1.HGF m RNA水平在AML初診未治療組、AML緩解組和健康對照組中的相對表達量(2-△CT)中位數(shù)分別為:8.096х10-3、1.271х10-3、2.598х10-3;HGF在AML初診未治療組的表達高于AML緩解組和健康對照組(p值分別為0.0002、0.0149);c-Met m RNA水平在AML初診未治療組、AML緩解組和健康對照組中的相對表達量(2-△CT)中位數(shù)分別為:3.988х10-3、0.231х10-3、0.497х10-3;c-Met在AML初診未治療組的表達高于AML緩解組和健康對照組(p值分別為0.0002、0.0150)。在AML初診未治療組HGFA水平高于健康對照組;而HAI-2 m RNA水平則低于健康對照組,但均與AML緩解組無統(tǒng)計學差別。HAI-1、Matriptase m RNA水平在各組中均無明顯變化。HGF表達水平與急性髓系白血病未治療未治療患者的性別、年齡、血紅蛋白、血小板水平、首療程緩解情況沒有直接的相關(guān)性,但其水平在高白細胞組、預(yù)后差的人群中表達較高,p值分別為0.0405、0.009,有統(tǒng)計學意義;HAI-1表達水平在預(yù)后分組差的人群中表達較高(p=0.0462)。而在高白細胞組中HAI-2 m RNA表達較低(p=0.03902)。2.成功建立穩(wěn)定干擾HGF的Kasumi-1、HL-60細胞株:q RT-PCR檢測顯示干擾組細胞HGF m RNA表達水平均下調(diào)。相對于對照組,干擾HGF的Kasumi-1、HL60細胞HGF m RNA含量分別下調(diào)77.31%、86.36%。Western blot結(jié)果亦驗證干擾了HGF的上述兩株細胞HGF蛋白表達有明顯下調(diào)。3.HGF基因沉默對穩(wěn)定株細胞增殖、凋亡和細胞侵襲能力的影響:a.CCK-8結(jié)果顯示HGF RNAi抑制Kasumi-1、HL60細胞增殖,day5時與陰性對照組相比,干擾組細胞增殖抑制率分別為54.16%、49.04%;b.克隆形成顯示:HGF RNAi后Kasumi-1、HL-60細胞的克隆形成能力受到抑制,克隆形成抑制率分別為35.95%、60.12%;c.流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示:HGF基因沉默后,兩株細胞的G2/M期細胞比例增多,S期細胞比例降低,說明細胞周期G2-M期轉(zhuǎn)換受到阻滯。d.細胞凋亡檢測結(jié)果顯示:Kasumi-1細胞中未轉(zhuǎn)染病毒組(Normal control組)、空載陰性對照組(Negative Control組)和干擾組(Knock Down組)細胞的總凋亡率分別為0.20%、5.86%及16.46%;而HL60細胞中未轉(zhuǎn)染病毒組(control組)、陰性對照組(NC組)和干擾組(KD組)細胞的總凋亡率分別為0.12%、2.48%及14.45%,兩株干擾組細胞凋亡率與對照組比較均顯著增高(p值分別為0.001、0.015)。e.FN粘附實驗、Transwell小室試驗結(jié)果顯示:Kasumi-1、HL60細胞干擾后粘附細胞數(shù)分別下降33.57%、51.54%,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(p值分別為0.00、0.001);Kasumi-1、HL60細胞干擾后穿膜細胞數(shù)分別下降22.19%、27.26%,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(p值分別為0.001、0.000),提示HGF基因沉默后細胞粘附及侵襲能力受到抑制。f.Western Blot檢測結(jié)果顯示:HGF RNAi后下調(diào)Kasumi-1細胞Bad、Bcl-XL、Bcl-2、CDK1、Cyclin B、MMP2、MMP9等蛋白表達下調(diào);cleaved caspase9、cleaved caspase3、cleaved PARP、Bax、P21蛋白表達上調(diào);c-Met、AKT、Erk、m TOR等蛋白磷酸化水平降低;Chk1、cdc25、PTEN磷酸化水平增高;對t-Akt、t-Raf、MMP7、pro-caspase8等蛋白影響不大。在HL-60細胞中,Bcl-2、P21蛋白含量變化不明顯,而Bax表達量增高,GSK3β磷酸化水平增高,而PTEN磷酸化水平無明顯變化。結(jié)論:1.HGF基因在急性髓系白血病細胞中高表達,且其表達水平與外周血白細胞數(shù)和預(yù)后相關(guān),治療緩解后HGF表達較前降低。c-Met、HGFA基因在急性髓系白血病中表達增高。HAI-2基因在急性髓系白血病中表達下調(diào),且與外周血白細胞數(shù)相關(guān)。2.HGF可能通過PI3K-AKT、MAPK/Erk通路促進急性髓系白血病細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移,下調(diào)HGF基因表達可抑制急性髓系白血病細胞的增殖及侵襲能力,促使其阻滯于G2/M期,發(fā)生caspase介導(dǎo)的凋亡。
[Abstract]:Objective : To study the expression of HGF in acute myeloid leukemia ( AML ) cells and to investigate the effect of HGF on the expression of HGF and its related genes c - Met , HFA , HAI - 1 , HAI - 2 , Matriptimim RNA and protein in acute myeloid leukemia ( AML ) . The results showed that HGF could inhibit the proliferation , apoptosis and cell invasion ability of HL - 60 cells . In HL - 60 cells , the expression levels of Bcl - 2 and P21 protein were decreased by 33.57 % and 51.54 % respectively .
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7

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本文編號：1983703