本文選題：大腸癌 + 腸道菌群�。� 參考：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。到目前為止,大腸癌的病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確,既往研究認(rèn)為多種因素參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展,包括飲食結(jié)構(gòu)、肥胖、運(yùn)動(dòng)以及個(gè)人的遺傳因素等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)及其代謝模式的改變可能在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。近來,腸道微生態(tài)改變引起腸癌發(fā)生發(fā)展已引起高度重視,而且已不斷有文獻(xiàn)報(bào)道具核梭桿菌在其中的作用。本研究正是基于我國人群特征,探索大腸癌患者的腸道菌群特征性改變,在腸道中尋找類似幽門螺桿菌的特異性致癌細(xì)菌并探討其與大腸癌預(yù)后的相關(guān)性。方法:(1)臨床樣品的收集。新鮮大腸癌(35例)及癌旁正常粘膜樣品(19例)、炎性腸病(包括克隆病和潰瘍型結(jié)腸炎,共20例)粘膜樣品及大腸腺瘤樣品(15例)來自上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心2011年9月至2012年9月的患者,經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí),大腸癌患者需進(jìn)一步手術(shù)治療。內(nèi)鏡檢查1周(腸道菌群結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常)后收集患者的糞便樣品;同時(shí)22例大腸癌患者分為兩組,術(shù)前分別口服益生菌制劑(培菲康散劑)和安慰劑一周,術(shù)中收集大腸癌粘膜樣品和癌旁正常粘膜樣品,術(shù)后一周收集糞便樣品。此外,15例健康志愿者正常腸黏膜樣品和糞便樣品由上海市閘北區(qū)社區(qū)居民提供。所有樣品均符合相應(yīng)的納入排除標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者和健康志愿者均簽署志愿者知情同意書。(2)大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)改變的檢測。利用QIAamp DNA試劑盒對標(biāo)本進(jìn)行基因組DNA抽提;利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA,對各標(biāo)本基因組DNA含量進(jìn)行鑒定;利用ABI GeneAmp對抽提的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物、繼而熒光定量;利用Roche GS FLX454測序儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的16S rRNA V3可變區(qū)進(jìn)行焦磷酸測序,通過SILVA數(shù)據(jù)庫將所測序列進(jìn)行序列比對,并經(jīng)good’s覆蓋率、多樣性指數(shù)、pca、lefse判別分析等多種方法對各組微生物種類進(jìn)行分類學(xué)和多樣性的比較,以期發(fā)現(xiàn)大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異性改變。(3)具核梭桿菌(fusobacteriumnucleatum,fn)和莓實(shí)假單胞菌(pseudomonasfragi,pf)的臨床驗(yàn)證。選擇2007年1月至2011年12月同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院283例行手術(shù)切除的大腸癌石蠟標(biāo)本。其中,男性患者144例,女性139例,年齡40-80歲,平均年齡67歲。首先進(jìn)行qrt-pcr檢測,利用mirneasyffpekit(qiagen,217504)試劑盒對上述石蠟樣品脫蠟,并對組織樣品的總rna進(jìn)行抽提;用逆轉(zhuǎn)錄酶reversetranscriptasem-mlv(d2640a,takara)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna;并設(shè)計(jì)和合成fn和pf菌的引物,最后通過realtimepcr儀進(jìn)行擴(kuò)增和定量。我們采用免疫熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization,fish)對大腸癌粘膜表面的fn和pf菌進(jìn)行定位檢測。(4)fn及pf表達(dá)水平與大腸癌預(yù)后的相關(guān)性分析。采用癌粘膜∶癌旁正常粘膜比值的50百分位數(shù)作為分界點(diǎn),即將比值高于分界點(diǎn)的病例歸入高fn表達(dá)組,而將比值低于分界點(diǎn)的病例歸入低fn表達(dá)組。同樣將比值高于分界點(diǎn)的病例歸入高pf表達(dá)組,而將比值低于分界點(diǎn)的病例歸入低pf表達(dá)組。將pf作為分層指標(biāo)對fn分層并進(jìn)一步分析。采用kaplan-meier法及l(fā)ogrank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。采用cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行大腸癌生存的單因素和多因素分析。(5)益生菌干預(yù)對大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。利用qiaampdnamini試劑盒對上述益生菌干預(yù)標(biāo)本進(jìn)行基因組dna抽提,后續(xù)基因組dna鑒定、pcr擴(kuò)增、熒光定量、16srrnav3可變區(qū)測序和生物信息學(xué)分析方法同前;分組比較大腸癌組與益生菌干預(yù)組粘膜表面菌群結(jié)構(gòu)的差異并探討益生菌干預(yù)大腸癌腸道菌群的可行性。結(jié)果:(1)焦磷酸測序研究結(jié)果表明,大腸癌患者的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)與健康對照人群相比具有顯著的差異。從門的水平來看,與正常人相比,大腸癌患者粘膜相關(guān)菌群中厚壁菌門(firmicutes)和梭桿菌門(fusobacteria)豐度顯著增加,而變形菌門(proteobacteria)豐度明顯下降;雖然擬桿菌門(bacteroidetes)和放線菌門(actinobacteria)在腫瘤組中豐度較高,但兩組間無顯著性差異;在屬水平上,大腸癌病人中l(wèi)actococcus(50.85%vs.25.35%,p=0.007),fusobacterium(10.08%vs.0.01%,p=0.032),escherichia shigella(2.92%vs.0.22%,p=0.004)豐度明顯高于健康人群,而flavobacterium,pedobacter,sphingobacterium,cau-lobacter,brevundimonas,sphingomonas,sphingomonas,acidovorax,buttiauxella,rahnella,acinetobacter,psychrobacter,pseudomonas,stenotro-phomonas,psychrobacter豐度則明顯降低。采用判別分析結(jié)合效應(yīng)大小模型(lefse),發(fā)現(xiàn)fusobacterium,prevotella及bacteroides構(gòu)成大腸癌患者腸粘膜的“核心菌群”,而pseudomonas和flavobacterium則構(gòu)成健康人群的“核心菌群”。糞便樣品具有與粘膜組織完全不同的菌群結(jié)構(gòu),主要表現(xiàn)在大腸癌患者的糞便firmicutes菌和bacteroidetes菌豐度明顯降低,而proteobacteria和actinobacteria豐度則明顯升高,fusobacteria在兩組中豐度都較低,差異沒有顯著性。對大腸癌患者的癌組織、癌旁組織及糞便樣品三者間的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)它們之間也存在明顯差異,bacteroidetes在癌旁粘膜上豐度最高,proteobacteria在糞便樣品中豐度最高,fusobacteria則在腫瘤粘膜上豐度最高,firmicutes在三者間的豐度逐漸降低,但差異沒有顯著性。本研究結(jié)果表明,正常人腸道內(nèi)存在兩個(gè)“核心菌群”,一個(gè)位于大腸粘膜,即粘膜相關(guān)“核心菌群”,可能主要通過與腸上皮直接接觸發(fā)揮作用;另一個(gè)位于腸腔內(nèi),即“腸腔相關(guān)核心菌群”,可能主要通過代謝調(diào)節(jié)腸道功能。正常情況下,這兩個(gè)“核心菌群”對維持健康的腸道功能發(fā)揮重要的作用,而“核心菌群”結(jié)構(gòu)的偏移與大腸癌的發(fā)生關(guān)系密切。(2)本研究對大腸癌差異菌fusobacterium和pseudomonas兩種菌與細(xì)菌庫進(jìn)行比對,從種的水平篩選出的差異菌分別為fusobacteriumnuclea-tum(fn)和pseudomonasfragi(pf)。qrt-pcr結(jié)果顯示fn在大腸癌粘膜表面富集,而pf則豐度明顯降低,與前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;其次,fish結(jié)果證實(shí)部分fn可侵入粘膜固有層,提示fn可能參與大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。(3)單因素和多因素預(yù)后分析結(jié)果顯fn表達(dá)情況是影響結(jié)腸癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素(hr=1.71,p=0.039),而pf表達(dá)水平與大腸癌預(yù)后關(guān)系不明顯,但以pf作為分層指標(biāo)對fn進(jìn)一步分層后發(fā)現(xiàn)fn對預(yù)后的影響更大,說明fn和pf的表達(dá)情況可以作為一個(gè)有價(jià)值的分子標(biāo)記物。(4)益生菌干預(yù)研究結(jié)果顯示,口服益生菌能明顯改善大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu),并特異性降低具有潛在治病性的Fn菌豐度,初步顯示出對大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)整能力。結(jié)論:大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生特征性改變,主要表現(xiàn)在核心菌群結(jié)構(gòu)的改變,以Fn和Pf為代表的核心菌群可能參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程;同時(shí),Fn在腫瘤局部的表達(dá)情況與大腸癌患者預(yù)后密切相關(guān),Fn高表達(dá)伴隨Pf的高表達(dá)預(yù)示著預(yù)后較差的;此外,益生菌干預(yù)能明顯改變大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu),降低Fn豐度。提示Fn及Pf可作為大腸癌風(fēng)險(xiǎn)篩查、治療策略和預(yù)后預(yù)測的一個(gè)潛在性指標(biāo)。此外,通過腸道益生菌干預(yù)可作為預(yù)防和治療大腸癌的一個(gè)可行性方案。
[Abstract]:Objective : Colorectal cancer is one of the most common malignant tumors of the digestive tract . So far , the etiology and pathogenesis of colorectal cancer are not clear . In recent years , it has been found that the changes of gut microecology and its metabolic pattern may play an important role in the development of colorectal cancer . ( 3 ) The clinical verification of the expression of fn and pf was carried out by means of fluorescence in situ hybridization ( RT - PCR ) . (5)鐩婄敓鑿屽共棰勫澶ц偁鐧屾?zhèn)ｈ�呰偁閬撹弻緹ょ粨鏋勭殑褰卞搷.鍒╃敤qiaampdnamini璇曞墏鐩掑涓婅堪鐩婄敓鑿屽共棰勬爣鏈繘琛屽熀鍥犵粍dna鎶芥彁,鍚庣畫鍩哄洜緇刣na閴村畾,pcr鎵╁,鑽у厜瀹氶噺,16srrnav3鍙彉鍖烘祴搴忓拰鐢熺墿淇℃伅瀛﹀垎鏋愭柟娉曞悓鍓，

本文編號：1980464