本文選題：低氧誘導(dǎo)因子1α + 納米載體　； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的由于缺乏有效的治療手段,胰腺癌患者的5年生存率低于5%。即使使用目前的一線化療藥物,吉西他濱(Gemcitabine,Gem),中晚期患者的中位總生存期只有5.0到7.2個月。因此,目前的胰腺癌治療領(lǐng)域亟待開發(fā)新的治療策略。由于缺乏血液供應(yīng),在胰腺癌組織中存在大量的低氧區(qū)域。腫瘤細(xì)胞之所以能夠在低氧環(huán)境下生存,是因?yàn)樵谀[瘤細(xì)胞內(nèi)部激活了大量的信號通路,在這其中低氧誘導(dǎo)因子1(HIF1,由氧濃度調(diào)節(jié)的HIF1α亞基和組成型表達(dá)的HIF1β亞基組成)是最重要的轉(zhuǎn)錄因子。近些年,HIF1α已經(jīng)成為一個新的腫瘤治療靶點(diǎn),許多HIF-1α抑制劑被開發(fā)出來,特別是化學(xué)小分子抑制劑。但由于缺乏特異性,這些化學(xué)小分子抑制劑在臨床試驗(yàn)中都顯示出明顯的副作用。利用小干擾RNA(si RNA)的RNA干擾技術(shù)是一種有效的選擇性抑制特定基因表達(dá)的方法。但是,裸的si RNA在血液循環(huán)中的半衰期低于1個小時,而且難以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。利用si RNA進(jìn)行體內(nèi)基因治療的關(guān)鍵就是尋找一個安全有效的基因輸運(yùn)納米載體。目前,用于si RNA輸運(yùn)的生物材料主要有兩類,聚合物和脂質(zhì)體。盡管有許多生物可降解的陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體被開發(fā)出來,但其表面高的正電荷導(dǎo)致的毒性依然是個問題。最近,一種新的si RNA載體被研究出來,這就是磷脂-聚合物混合型納米載體。這種新型納米載體的結(jié)構(gòu)一般為:核心是一個聚合物,然后在表面覆蓋一個磷脂單分子層或雙分子層,這樣就能將兩種載體的優(yōu)勢結(jié)合起來。但目前使用這種載體進(jìn)行藥物和si RNA的聯(lián)合輸運(yùn)的研究仍然很少。在這項(xiàng)研究中,我們設(shè)計(jì)了一種磷脂-聚合物混合型納米載體,可以高效的同時輸運(yùn)吉西他濱和針對HIF1α的si RNA(si-HIF1α)用于胰腺癌的治療。所用的材料都已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用作臨床藥物或食品添加劑。除了納米載體的設(shè)計(jì)和合成外,我們還會重點(diǎn)關(guān)注外層的磷脂雙分子層對納米載體穩(wěn)定性、藥物滲漏速率和si RNA輸運(yùn)效率的影響,并對比不同納米制劑在小鼠胰腺癌皮下模型和原位模型中的抗腫瘤效應(yīng)。方法一、HIF1α在胰腺癌細(xì)胞中對細(xì)胞增殖和吉西他濱敏感性的影響。1、利用Lipofactamine 2000將si RNA轉(zhuǎn)染至Panc-1細(xì)胞中,并用western分析HIF1α的表達(dá)水平.2、干擾HIF1α的表達(dá)后,利用CCK-8試劑盒檢測Panc-1細(xì)胞的增殖速度。3、將si-HIF1α和陰性對照si RNA(si-ctrl)轉(zhuǎn)染入Panc-1細(xì)胞中,用Gem對細(xì)胞進(jìn)行處理后,利用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的生存率,來研究HIF1α對吉西他濱敏感性的影響。二、納米載體的設(shè)計(jì)、合成和表征。1、設(shè)計(jì)一種新型的磷脂-聚合物混合型納米載體納米載體用于同時輸運(yùn)Gem和si-HIF1α:設(shè)計(jì)出的納米載體由一個陽離子聚合物核心和表面覆蓋的PEG化的磷脂雙分子層組成。核心的陽離子聚合物是由EPL改性后的m PEG-PLGA(ENPs),具有很高的表面正電荷,Gem可以被有效的包裹在其親水性核心,同時表面通過靜電吸附帶有負(fù)電荷的si-HIF1α;吸附之后,表面再覆蓋一層PEG化的磷脂雙分子層(LENPs),其可以減少Gem和si RNA的滲漏,并且提高納米載體在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性。2、位于LENPs核心的ENPs通過復(fù)乳法進(jìn)行合成;表面的磷脂層則通過超聲薄膜法進(jìn)行自組裝。3、不同納米載體的粒徑分布和表面電位通過動態(tài)光散射(DLS)進(jìn)行測量。4、利用透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行不同納米載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察。5、通過高效液相色譜法(HPLC)測量ENPs對吉西他濱的包載率;對核酸的吸附能力則通過表面電位的變化以及核酸電遷移率變化進(jìn)行檢測。6、將不同的納米載體在FBS里孵育不同時間后,通過觀察納米粒子的粒徑分布變化來檢測納米載體的血清穩(wěn)定性。7、利用HPLC和電泳檢測從納米載體上釋放出來的Gem和核酸。三、納米粒子在體內(nèi)外的siRNA輸運(yùn)效果的表征。1、利用熒光物質(zhì)標(biāo)記siRNA后,通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞對LENPs輸運(yùn)的si RNA的攝取及其細(xì)胞內(nèi)定位。2、利用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞內(nèi)的Actin進(jìn)行染色并通過激光共聚焦顯微鏡觀察,來檢測針對Actin的si RNA的干擾效果;si-HIF1α的干擾效果則通過免疫印跡和實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行檢測。3、利用納米載體進(jìn)行載運(yùn)熒光物質(zhì)標(biāo)記的si RNA后,將其注射入小鼠體內(nèi),利用小鼠活體成像系統(tǒng)檢測血中和器官中的熒光強(qiáng)度,來確定si RNA在體內(nèi)的半衰期和腫瘤靶向性。四、不同納米制劑在體內(nèi)外的抗腫瘤效果評價(jià)1、利用不同納米制劑對細(xì)胞進(jìn)行處理后,細(xì)胞的存活率通過CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測,來確定不同納米制劑的體外抗腫瘤效果。2、體內(nèi)的抗腫瘤效果分別在小鼠的胰腺癌皮下移植瘤和原位移植瘤模型中進(jìn)行檢測。結(jié)果干擾HIF1α的表達(dá)后,Panc-1細(xì)胞的增殖明顯受到抑制,同時其對Gem的敏感性也明顯提高。通過復(fù)乳法,我們成功合成出ENPs,其具有良好的包載Gem的能力(在m PEG-PLGA:Gem的質(zhì)量比為80:1時,包載率最高,為42%),同時ENPs具有很強(qiáng)的吸附核酸的能力。與ENP-Gem-DNA相比,表面覆蓋了磷脂雙分子層的LENP-Gem-DNA的結(jié)構(gòu)和粒徑?jīng)]有明顯區(qū)別,但其表面電位變?yōu)?34m V。由于表面覆蓋的磷脂雙分子層,LENP-Gem-DNA在血清中的穩(wěn)定性比ENP-Gem-DNA更好,同時DNA的滲漏也明顯減少;而無論在p H7.4還是p H4.4的條件下,LENP-Gem的Gem滲漏都低于ENP-Gem。LENPs載運(yùn)的si RNA可以被細(xì)胞攝取,進(jìn)入細(xì)胞的溶酶體內(nèi),并最終從溶酶體里面逃逸出來。LENPs載運(yùn)的si RNA的體外干擾效果明顯強(qiáng)于ENPs載運(yùn)的si RNA。在體內(nèi),LENPs的穩(wěn)定性優(yōu)于ENPs,其循環(huán)時間更長。這些特性都有利于LENPs通過增強(qiáng)腫瘤血管效應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)在腫瘤組織的靶向富集。最終,在小鼠皮下移植瘤模型中LENP-Gem-si-HIF1α展現(xiàn)出明顯強(qiáng)于ENP-Gem-si-HIF1α的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng),另外在原位胰腺癌模型中,LENP-Gem-si-HIF1α可以有效地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)論總而言之,我們合成了一種具有生物相容性的磷脂-聚合物混合型納米載體,實(shí)現(xiàn)了si-HIF1α和Gem的共同轉(zhuǎn)運(yùn),這種納米藥物在皮下腫瘤模型和原位胰腺癌模型中展示出良好的抗腫瘤效果。這種新型納米載體具有優(yōu)秀的血液循環(huán)穩(wěn)定性,同時具有優(yōu)秀的體內(nèi)si RNA載運(yùn)功能,為將來si RNA和化療藥物在納米藥物中的聯(lián)合輸運(yùn)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In recent years , HIF1 偽 has become a new tumor therapy target , and many HIF - 1偽 inhibitors have been developed , especially for chemical small molecule inhibitors . A novel phospholipid - polymer hybrid nano - carrier was designed , synthesized and characterized . The results show that the stability of LENPs is superior to that of ENPs . In vivo , the stability of LENPs is superior to that of ENPs . In addition , LENP - Gems - si - HIF1偽 exhibits a better antitumor effect than ENP - Gems - si - HIF1 . Conclusion In vivo , LENP - Gems - si - HIF1偽 exhibits a better antitumor effect than ENP - Gems - si - HIF1 . Conclusion In vivo , LENP - Gems - si - HIF1偽 exhibits a better antitumor effect than ENP - Gems - si - HIF1 .
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9

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本文編號：1976293