本文選題：他莫昔芬 + M2型丙酮酸激酶��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:探討4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)對(duì)M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase,PKM2)表達(dá)的影響,研究PKM2與MST1(Mammalian Sterile20-like kinase 1,MST1)相互作用的機(jī)制及其對(duì)MST1介導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SKBR3凋亡的影響。方法:1.4-OHT處理人乳腺癌MCF-7、SKBR3細(xì)胞及人正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞后,流式檢測(cè)4-OHT對(duì)MCF-7、SKBR3和MCF-10A細(xì)胞凋亡的影響,Western blot檢測(cè)細(xì)胞PKM2、Cleaved-Caspase3以及MST1的表達(dá)情況。用4-OHT濃度梯度法長期誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,獲得他莫昔芬耐藥細(xì)胞株MCF-7R,并用CCK-8檢測(cè)MCF-7和MCF-7R對(duì)4-OHT的藥物敏感性,Western blot檢測(cè)PKM2的表達(dá)。2.Co-IP實(shí)驗(yàn)證明PKM2與MST1存在相互作用,并找出與PKM2作用的MST1的變構(gòu)體,免疫熒光檢測(cè)PKM2與MST1在細(xì)胞內(nèi)定位情況。3.構(gòu)建PKM2的shRNA慢病毒,感染乳腺癌MCF-7細(xì)胞株,用4-OHT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,采用Western blot檢測(cè)PKM2干擾后,乳腺癌細(xì)胞MCF-7和SKBR3中凋亡蛋白Cleaved-Caspase3和MST1蛋白的表達(dá),核漿分離和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MST1的分布情況。4.在4-OHT處理細(xì)胞的基礎(chǔ)上,通過干擾或者過表達(dá)PKM2蛋白,同時(shí)過表達(dá)MST1,Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表達(dá),流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)生的比例。結(jié)果:1.流式和Western blot結(jié)果表明,4-OHT能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞SKBR3和MCF-7發(fā)生凋亡,對(duì)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A凋亡沒有影響;隨著濃度的增高,PKM2表達(dá)逐漸減少,cl-Casepase3和cl-MST1逐漸增多。他莫昔芬耐藥細(xì)胞株MCF-7R的PKM2表達(dá)量明顯升高。2.Co-IP結(jié)果顯示MST1與PKM2存在相互作用,且與PKM2相互作用的MST1的變構(gòu)體為cl-MST1,他莫昔芬能明顯減弱此蛋白間的相互作用。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,在MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞中,PKM2與MST1主要共定位于細(xì)胞漿中。3.采用sh-PKM2慢病毒感染乳腺癌MCF-7細(xì)胞,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PKM2的表達(dá)顯著減少,cl-MST1增多,核漿蛋白分離實(shí)驗(yàn)和免疫熒光證實(shí),PKM2干擾能夠促進(jìn)MST1剪切后入核,從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。4.Western blot結(jié)果表明,PKM2過表達(dá)能夠抑制凋亡蛋白cl-Caspase3的表達(dá),反之,PKM2干擾能夠增強(qiáng)cl-Caspase3的表達(dá)。流式結(jié)果表明,PKM2過表達(dá)能夠抑制MST1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用,反之,PKM2干擾能夠增強(qiáng)MST1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。結(jié)論:1.他莫昔芬促進(jìn)乳腺癌MCF-7和SKBR3細(xì)胞凋亡,并且下調(diào)PKM2的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)cl-MST1的表達(dá)。2.MST1與PKM2存在相互作用,與PKM2相互作用的MST1的變構(gòu)體為cl-MST1.3.干擾PKM2能夠上調(diào)cl-MST1并促進(jìn)其入核。4.PKM2抑制MST1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,PKM2可能是MST1上游的調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡的重要靶點(diǎn)。
[Abstract]:Aim: to investigate the effect of 4-hydroxytamoxifenn 4-OHT on the expression of M2-pyruvate kinase M2-pyruvate kinasePKM2, and to study the mechanism of interaction of PKM2 with MST1(Mammalian Sterile20-like kinase 1 MST1 and its effect on apoptosis of MCF-7SKBR3 cell line MCF-7SKBR3 mediated by MST1. Methods Human breast cancer MCF-7 SKBR3 cells and normal breast epithelial MCF-10A cells were treated with: 1.4-OHT. The effect of 4-OHT on apoptosis of MCF-7SKBR3 and MCF-10A cells was detected by flow cytometry. The expression of PKM2Cleaved-Caspase3 and MST1 in MCF-7SKBR3 and MCF-10A cells were detected by Western blot. Human breast cancer MCF-7 cells were induced by 4-OHT concentration gradient method for a long time, and tamoxifen resistant cell line MCF-7R was obtained. The expression of PKM2 was detected by MCF-7 and MCF-7R sensitivity to 4-OHT by CCK-8. 2. Co-IP experiments showed that PKM2 interacted with MST1. The mutagenesis of MST1 interacting with PKM2 was found, and the localization of PKM2 and MST1 in cells was detected by immunofluorescence. ShRNA lentivirus of PKM2 was constructed and infected with MCF-7 cell line of breast cancer. Apoptosis was induced by 4-OHT. Western blot was used to detect the expression of Cleaved-Caspase3 and MST1 proteins in MCF-7 and SKBR3 of breast cancer cells after PKM2 interference. Nuclear and cytoplasmic isolation and immunofluorescence assay were used to detect the distribution of MST1 in cells. On the basis of 4-OHT treatment, the expression of PKM2 protein was detected by interfering or overexpressing PKM2 protein, and the expression of apoptotic protein Cleaved-Caspase3 was detected by overexpression of MST1 blot, and the percentage of apoptosis was detected by flow cytometry. The result is 1: 1. The results of flow cytometry and Western blot showed that 4-OHT could induce apoptosis of SKBR3 and MCF-7 in breast cancer cells, but had no effect on MCF-10A apoptosis of normal breast epithelial cells, and decreased the expression of MCF-10A M2 and increased cl-MST1 gradually with the increase of concentration. The expression of PKM2 in tamoxifen resistant cell line MCF-7R was significantly increased. 2. The results of co-IP showed that MST1 interacted with PKM2, and the MST1 interacting with PKM2 was cl-MST1, and tamoxifen could attenuate the interaction between MST1 and PKM2. Immunofluorescence assay showed that PKM2 and MST1 were mainly located in cytoplasm of MCF-7 and SK-BR-3 cells. Western blot assay of breast cancer MCF-7 cells infected with sh-PKM2 lentivirus showed that the expression of PKM2 decreased significantly. The nucleoplasma protein separation assay and immunofluorescence confirmed that PKM2 interference could promote the entry of MST1 into the nucleus after shearing. The results of Western blot showed that the overexpression of PKM2 could inhibit the expression of apoptotic protein cl-Caspase3, whereas the interference of PKM2 could enhance the expression of cl-Caspase3. The results of flow cytometry showed that the overexpression of PKM2 could inhibit the apoptosis induced by MST1, whereas the interference of PKM2 could enhance the apoptosis induced by MST1. Conclusion 1. Tamoxifen promoted the apoptosis of MCF-7 and SKBR3 cells and down-regulated the expression of PKM2 in breast cancer. At the same time, it promoted the expression of cl-MST1. 2. MST1 interacted with PKM2, and the variant of MST1 interacting with PKM2 was cl-MST1.3. Interfering with PKM2 can up-regulate cl-MST1 and promote its entry. 4. PKM2 inhibits apoptosis mediated by MST1. PKM2 may be an important target of MST1 upstream in regulating apoptosis of breast cancer cells.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：1972509