本文選題：原發(fā)性肝癌 + 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景和目的原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一,其起病隱匿、且發(fā)展迅猛,我國每年死于原發(fā)性肝癌的患者約11萬例數(shù),其死亡率已上升為農(nóng)村和城市惡性腫瘤死亡率的第一位和第二位。在我國,肝癌的誘發(fā)因素主要為乙型肝炎病毒感染,約有80%-90%的肝癌患者攜帶乙型肝炎病毒,其余誘發(fā)因素包括丙型肝炎病毒感染、酒精肝及黃曲霉素等。目前,手術(shù)切除仍然被認(rèn)為是根治HCC的重要手段之一。然而,大部分HCC患者診斷時已屬于中晚期,統(tǒng)計結(jié)果表明HCC患者中僅有約15%的患者適合行手術(shù)切除治療。且較之其他惡性腫瘤,HCC存在其特殊的生物學(xué)行為,包括肝硬化背景、多中心癌前病變的存在、早期即能侵犯門靜脈及發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等。在合并肝硬化肝臟功能儲備下降的情況下,患者往往難以承受外科手術(shù)；且針對肝內(nèi)多發(fā)病灶的情況,外科手術(shù)難以對病灶一一切除,上述原因大大的限制了外科手術(shù)在HCC中的應(yīng)用。因此,近年來以經(jīng)動脈導(dǎo)管栓塞化療(Transcatheter aterial chemoembolization, TACE)和射頻消融(Radiofrequency Ablation)等為代表的微創(chuàng)治療越來越受到人們的關(guān)注。與傳統(tǒng)外科手術(shù)相比,微創(chuàng)治療能夠最大限度的保存正常肝臟組織同時達(dá)到治療腫瘤的目的。目前,TACE序貫消融治療聯(lián)合多吉美靶向治療已成為治療肝癌的基本模式。然而,盡管微創(chuàng)治療在一些早期肝癌的治療中取得了長足的進(jìn)步,HCC的5年生存率并沒有得到明顯的改善,大部分患者在接受外科手術(shù)、射頻消融等根治性治療后往往出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。正如其他腫瘤一樣,HCC中似乎也存在著一小部分具有不定向分化和自我更新能力的干細(xì)胞,即腫瘤干細(xì)胞。國外學(xué)者Reya等早年間提出腫瘤干細(xì)胞的觀點,認(rèn)為腫瘤通常由正常的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來,且這部分細(xì)胞往往對放化療不敏感,是腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。因而,尋找能針對靶向腫瘤干細(xì)胞的治療是提高患者手術(shù)療效,延長患者生命的關(guān)鍵。為了更進(jìn)一步的研究腫瘤干細(xì)胞的特性并將其作為一個未來靶向治療的靶點,腫瘤干細(xì)胞的分離及鑒定成為了一個重點。近幾年來,關(guān)于肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的報道逐漸增多,其中包括CD133、EpCAM、CD13、CD4、CD90、CD24等。盡管從各個實驗室分離得到的帶有這些標(biāo)志物的細(xì)胞都具有相似的干細(xì)胞特性,但目前尚未有公認(rèn)的肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物。Nanog基因是一種在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、原始生殖細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。近年來發(fā)現(xiàn),Nanog基因不僅在維持胚胎干細(xì)胞的全能型方面起著重要作用,而且在多種腫瘤中均有表達(dá),其中包括乳腺癌、膀胱癌、腦膠質(zhì)瘤等。且Nanog還是一個預(yù)后預(yù)測因子,Nanog表達(dá)越強,則臨床預(yù)后越差。研究發(fā)現(xiàn)Nanog不僅在多種腫瘤于細(xì)胞中表達(dá),且還是維持腫瘤干細(xì)胞自我更新能力及多向分化潛能的重要因子。國內(nèi)學(xué)者shan等利用Nanog啟動子攜帶外源性GFP報告基因的慢病毒載體分離得到了一小群Nanog陽性的肝癌細(xì)胞,并證實了這部分細(xì)胞具有干性的特征,包括干性基因的上調(diào)及自我更新能力等。因此,我們借鑒這種方法并構(gòu)建了LV-PNanog-GFP-T2A-Luc慢病毒載體,借此在體內(nèi)外實驗中能更直觀的觀察肝癌干細(xì)胞。近年來,免疫治療的快速發(fā)展給腫瘤治療帶來了曙光。其中,細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine induced killer cells, CIK cells)能在體外大量擴增,具有強大的抗瘤效應(yīng)。CIK細(xì)胞是由人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子(包括CD3單抗、IL-2、IFN-γ等)刺激擴增后得到的一群異質(zhì)性細(xì)胞,其主要的效應(yīng)細(xì)胞為CD3/CD56雙陽性細(xì)胞,因為同時具有T細(xì)胞及NK細(xì)胞的表型特征,它又被成為NK細(xì)胞樣的T淋巴細(xì)胞。較之其他過繼性免疫治療,CIK細(xì)胞體外增值速度快,且具有非MHC限制性殺瘤特點,已在臨床上得到廣泛的運用。目前,CIK細(xì)胞過繼性免疫治療已被綜合運用于腫瘤治療當(dāng)中,特別是在臨床上評價腫瘤達(dá)到CR (Complete response)或在腫瘤根治性手術(shù)后。在肝癌的臨床應(yīng)用中,已有文獻(xiàn)報道CIK聯(lián)合手術(shù)或者微創(chuàng)治療能顯著提高患者生存率、降低腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率。眾所周知,腫瘤干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。然而,CIK細(xì)胞是否通過殺傷肝癌干細(xì)胞從而降低肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率卻不得而知,且CIK細(xì)胞免疫治療降低肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率的相關(guān)機制均未見文獻(xiàn)報道。本文旨在探討CIK細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞的影響及其機制,為CIK聯(lián)合微創(chuàng)及手術(shù)治療提供堅實的理論基礎(chǔ)。方法第一部分CIK細(xì)胞培養(yǎng)體系建立及體外抑瘤活性探討1.健康成人外周血中單個核細(xì)胞(PBMC)的分離,采集健康成人新鮮血液后利用淋巴細(xì)胞分離液將其分離。依次加入不同的細(xì)胞因子包括抗CD3單抗、IFN-γ、PHA以及IL-2等進(jìn)行擴增、培養(yǎng)；2.CIK細(xì)胞的表型檢測,收集不同天數(shù)的CIK細(xì)胞,孵育針對不同細(xì)胞表型的流式熒光抗體后利用流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志；3.CCK8實驗檢測培養(yǎng)成熟的CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)；4.平板克隆實驗檢測CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響；5. Transwell及Boyden小室實驗檢測CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響；6.腫瘤成球?qū)嶒灆z測CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞成球能力的影響；7.統(tǒng)計分析該部分使用GraphPad Prism5進(jìn)行繪圖,采用SPSS20.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗(Two sample t-test),若方差不齊,則采用校正t檢驗法。多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齊不性,則采用Walch法進(jìn)行校正,對照組與實驗組的的多重比較采用Dunnett test。以P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。第二部分CIK細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞的殺傷作用探討1.構(gòu)建LV-PNanog-GFP-T2A-Luc質(zhì)粒2.質(zhì)粒提取、純化3.穩(wěn)定細(xì)胞株建立將pMD2.G、psPAX2和目的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,生產(chǎn)慢病毒,感染肝癌細(xì)胞,建立穩(wěn)定攜帶PNanog-GFP-T2A-Luc的肝癌細(xì)胞株。4.流式細(xì)胞儀分析GFP陽性細(xì)胞的比例,小動物活體成像儀體外檢測Luc信號5.流式細(xì)胞儀分選出GFP陽性及GFP陰性的腫瘤細(xì)胞。5.提取GFP陽性及GFP陰性腫瘤細(xì)胞的RNA,按照按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,qRT-PCR檢測干性相關(guān)基因表達(dá)水平。6.通過平板克隆實驗、成球能力分析及Transwell及Boyden小室實驗鑒定GFP陽性細(xì)胞干性特征。7.CCK8實驗比較CIK細(xì)胞對GFP陽性及GFP陰性的腫瘤細(xì)胞的殺傷效率。8. Time-Lapse實驗直觀觀察CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞及腫瘤球之間相互作用的過程。9. NOD/SCID小鼠皮下成瘤實驗。10.小鼠成瘤后,每兩天予以不同比例CIK細(xì)胞治療,同時游標(biāo)卡尺檢測腫瘤體積、小動物活體成像儀檢測Luc信號變化。11.組織層面上檢測瘤組織中CIK細(xì)胞相關(guān)CD5、CD56分子的表達(dá)。12.免疫組化檢測瘤組織增殖相關(guān)指標(biāo)BrdU、Ki67及干性相關(guān)指標(biāo)GFP的表達(dá)。13.統(tǒng)計學(xué)分析該部分使用GraphPad Prism5進(jìn)行繪圖,采用SPSS20.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗(Two sample t-test),如果對照組為常數(shù),則采用單樣本t檢驗(One sample t-test),若方差不齊,則采用校正t檢驗法。多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齊不性,則采用Walch法進(jìn)行校正,對照組與實驗組的的多重比較采用Dunnett test。小鼠治療期間Luc信號檢測和腫瘤體積的比較的采用重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析。以P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。第三部分CIK細(xì)胞殺傷腫瘤干細(xì)胞相關(guān)機制探討1.NKG2D阻斷實驗CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)前使用NKG2D抗體進(jìn)行阻斷封閉30分鐘后,再與腫瘤細(xì)胞相互作用,后續(xù)相關(guān)平板克隆、CCK8、腫瘤成球培養(yǎng)等驗證NKG2D分子的功能。2.TUNEL檢測細(xì)胞凋亡腫瘤細(xì)胞與CIK細(xì)胞按一定比例共培養(yǎng)4小時后,PBS漂洗去多余的CIK細(xì)胞,再按凱基TUNEL試劑盒說明行TUNEL檢測。3. ELISA檢測CIK細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子將腫瘤細(xì)胞與CIK細(xì)胞按1：10的比例共培養(yǎng)24小時后,留取培養(yǎng)上清以ELISA方法檢測細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10等。4.統(tǒng)計學(xué)分析該部分使用GraphPad Prism5進(jìn)行繪圖,采用SPSS20.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齊不性,則采用Walch法進(jìn)行校正,樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD法；如方差不齊,多重比較采用Dunnett's T3法。CIK細(xì)胞殺傷GFP陽性腫瘤細(xì)胞效應(yīng)的比較采用析因設(shè)計資料的方差分析。以P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果第一部分CIK細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立及體外抑瘤活性探討1.CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增及表型檢測健康成人外周血單個核細(xì)胞經(jīng)過多種細(xì)胞因子共同刺激后,于3天后細(xì)胞開始形成集落。隨著培養(yǎng)時間延長,細(xì)胞數(shù)量迅速增加,而且集落增多、增大,在此過程中,細(xì)胞體積開始增大。經(jīng)過2周的培養(yǎng)時間后,CIK細(xì)胞數(shù)量可達(dá)到8×108左右,細(xì)胞計數(shù)較培養(yǎng)前擴增約50倍左右,培養(yǎng)過程中臺盼藍(lán)染色檢測活細(xì)胞比例均在95%以上。我們通過流式細(xì)胞儀監(jiān)測不同天數(shù)CIK細(xì)胞表型,隨著培養(yǎng)天數(shù)增加,CIK細(xì)胞主要效應(yīng)細(xì)胞CD3/CD56雙陽性細(xì)胞比例顯著增加,由第七天4.7±2.5%到第21天增加至55.2±13.2%。同時,CD8陽性細(xì)胞比例也顯著增加(D7：69.1±5.1%D21：92.1±2.9%),而CD4陽性細(xì)胞比例則逐漸減少(D7：25.6±4.7%；D21：2.7±1.0%)。我們還檢測了CIK細(xì)胞表面NKG2D分子的表達(dá),NKG2D分子由第七天73.1±3.0%到第21天增加至92.1±2.9%。2.CIK細(xì)胞能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖CCK8實驗結(jié)果顯示,CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用,且隨著CIK作用比例升高,其抑制作用更明顯,其抑瘤率在1：5時為58.3±1.5%(SMMC7721)和67.3±2.5%(Huh7),而在1：50時升高至86±2.0%(SMMC7721)和94±2.0%(Huh7)。平板克隆實驗顯示,在1：5,1：10,1：30三個比例作用后,兩個細(xì)胞株克隆形成能力分別下降了45%,72.9%,92.4%(SMMC7721)和43.4%,80%,92.2%(Huh7)。方差分析顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異(F=59.644,P0.001；F=65.519,P0.001)。3.CIK細(xì)胞處理后,肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力下降,且成球能力下降CIK細(xì)胞不止抑制腫瘤細(xì)胞增殖,我們還發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞處理過后的肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力及成球能力均有一定的下降。Transewell及Boyden小室實驗顯示,與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)24小時后,肝癌細(xì)胞的遷移能力分別下降了83.5%(SMMC7721)和58.1%(Huh7),而侵襲能力下降了58.7%(SMMC7721)和82%(Huh7),兩獨立樣本t檢驗顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=6.945,P=0.001;t=6.743, P0.001; t=13.6635 P0.001; t=8.265, P=0.001)(表1-2,圖1-5)。而同時通過腫瘤球培養(yǎng),CIK處理后的肝癌細(xì)胞成球能力也有一定程度的下降,在1：10和1：30兩個比例時,其成球能力分別下降了36.8%,87.2%(SMMC7721)和40.9%,89.2%(Huh7),方差分析顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異(F=81.214, P0.001; F=70.813, P0.001)。第二部分CIK細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞的殺傷作用探討1.穩(wěn)定表達(dá)LV-PNanog-GFP-T2A-Luc的肝癌細(xì)胞株的建立及其干性鑒定為了進(jìn)一步驗證CIK細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞的殺傷活性,我們構(gòu)建了LV-PNanog-GFP-T2A-Luc慢病毒載體。建立穩(wěn)定HCC細(xì)胞株后,通過流式細(xì)胞儀檢測兩個穩(wěn)定細(xì)胞株SMMC7721及Huh7 GFP陽性細(xì)胞比例分別約為5.3%及3.9%(圖2-1B)。同時,我們還利用小動物活體成像儀檢測SMMC7721細(xì)胞株Luc信號,在104水平可檢測到Luc信號表達(dá),且與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。建立穩(wěn)定細(xì)胞株后,我們通過qRT-PCR方法檢測了常見的干細(xì)胞相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞干性基因表達(dá)明顯上調(diào),包括Nanog, Oct4, Sox2,兩獨立樣本t檢驗顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異(P均小于0.05)。接下來,我們對分選出來的GFP陽性細(xì)胞進(jìn)行成球能力分析。發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞具有更強腫瘤成球能力,其成球能力是GFP陰性細(xì)胞的2.6倍左右,兩獨立樣本t檢驗顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=13.714,P0.001)。而同時通過Transwell和Boyden小室實驗,我們發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞具有更強的遷移、侵襲能力,兩獨立樣本t檢驗顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=14.442, P=0.004; t=6.189, P=0.003)。而克隆形成實驗也得到相符的結(jié)果,GFP陽性細(xì)胞的克隆形成能力約為GFP陰性細(xì)胞的2.5倍(t=10.575；P=0.00)。通過體外實驗,我們發(fā)現(xiàn)GFP陽性的腫瘤細(xì)胞干性基因表達(dá)上調(diào),具有更強的腫瘤成球能力、遷移侵襲能力及克隆形成能力。2.CIK細(xì)胞體外殺傷GFP陽性細(xì)胞及腫瘤球再對GFP陽性細(xì)胞功能做了初步驗證后,我們利用CCK8實驗驗證了CIK細(xì)胞對GFP陽性及GFP陰性細(xì)胞之間的殺傷效應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),CIK細(xì)胞對兩者殺傷效率并無明顯差異(F=0.201, P=0.66; F=0.465, P=0.505)。為了更進(jìn)一步動態(tài)觀察CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞、腫瘤球之間作用的過程,我們使用Time-Lapse技術(shù)拍攝了相關(guān)的視頻。隨著拍攝時間延長,腫瘤細(xì)胞(包括GFP陽性細(xì)胞)由于趨化作用周圍CIK細(xì)胞逐漸增多,最后被CIK細(xì)胞包圍并攻擊,形成細(xì)胞團(tuán)塊。而在CIK細(xì)胞與腫瘤球相互作用的視頻中可見,腫瘤球由一開始規(guī)則、圓潤的球體,逐漸被CIK細(xì)胞攻擊、吞噬,最后被CIK細(xì)胞裂解,而且其綠色熒光信號逐漸減弱。通過體外殺傷實驗及視頻結(jié)果,我們初步證實了,CIK不僅能夠殺傷普通腫瘤細(xì)胞,而且其對以GFP陽性為代表的腫瘤干細(xì)胞也具有一定的殺傷作用。3.CIK細(xì)胞體內(nèi)殺傷GFP陽性細(xì)胞為了更進(jìn)一步驗證CIK細(xì)胞對腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用,我們利用攜帶LV-PNanog-GFP-T2A-Luc的肝癌細(xì)胞株SMMC7721行皮下成瘤后使用不同比例CIK細(xì)胞治療小鼠。結(jié)果顯示大劑量CIK細(xì)胞治療組小鼠腫瘤體積較空白對照組顯著降低(P0.05),且瘤重顯著降低(F=4.615,P=0.027)。通過小動物活體成像,我們發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,CIK細(xì)胞治療組較空白對照組Luc信號顯著降低,重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析顯示組間有顯著差異(F=17.206,P0.001),第9天開始,CIK細(xì)胞治療組Luc信號較空白對照組顯著降低(P0.05)。Luc信號強度間接反應(yīng)著腫瘤內(nèi)干細(xì)胞含量,CIK細(xì)胞治療能顯著降低Luc信號,預(yù)示著CIK細(xì)胞治療在小鼠體內(nèi)對干細(xì)胞也有一定的殺傷效應(yīng)。我們?nèi)〔暮笸ㄟ^免疫組化對以上結(jié)論進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。首先,通過CIK細(xì)胞表面特異性的標(biāo)志CD5、CD56染色,我們證實了CIK細(xì)胞確實到達(dá)了瘤體。而后,通過免疫組化實驗我們發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞治療組增殖相關(guān)指標(biāo)BrdU、Ki67標(biāo)記陽性細(xì)胞比例均較空白對照組下降(F=1065.06, P0.001; F=387.165,P0.001)。且GFP陽性細(xì)胞比例較空白對照組顯著下降(F=39.857,P=0.004),說明CIK細(xì)胞在小鼠體內(nèi)不僅能抑制腫瘤增殖,還對腫瘤干細(xì)胞具有一定的殺傷作用,這與Luc信號檢測結(jié)果相符。第三部分 CIK細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞的殺傷機制探討1.NKG2D受體阻斷后,CIK細(xì)胞對GFP陽性細(xì)胞殺傷效應(yīng)下降,且腫瘤細(xì)胞增殖、成球能力回復(fù)通過CCK8殺傷實驗,我們發(fā)現(xiàn)使用抗體將CIK細(xì)胞表面的NKG2D配體封閉后,CIK細(xì)胞殺傷GFP陽性腫瘤細(xì)胞效應(yīng)顯著下降。析因設(shè)計資料的方差分析顯示不同分組間具有顯著差異(F=24.953,P0.001; F=46.369, P0.001).克隆形成實驗及腫瘤成球?qū)嶒烇@示,使用抗體阻斷CIK細(xì)胞表面NKG2D分子后,腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力及成球能力均得到一定的回復(fù),單因素方差分析顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異(F=22.282, P=0.002; F=31.903, P=0.001); (F=16.884, P=0.003; F=17.889, P=0.003)。2.CIK細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡通過TUNEL檢測,我們發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過CIK細(xì)胞處理4個小時后,腫瘤細(xì)胞包括GFP陽性腫瘤細(xì)胞均發(fā)生明顯的凋亡。3.CIK細(xì)胞釋放細(xì)胞因子ELISA檢測通過ELISA檢測,我們發(fā)現(xiàn)CIK與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)釋放大量的IFN-y,其釋放濃度分別達(dá)到295.3±22.7Pg/ml與88.4±4.2Pg/ml,其他細(xì)胞因子包括IL-2、 TNF-αIL-4、IL-6、IL-10等雖有釋放,然而其釋放濃度較低。結(jié)論1.外周血單個核細(xì)胞經(jīng)過多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)后可培養(yǎng)成為成熟的CIK細(xì)胞,且主要效應(yīng)細(xì)胞CD3/CD56雙陽性細(xì)胞比例在培養(yǎng)2-3周后達(dá)到高峰；同時,隨著培養(yǎng)時間延長,CIK細(xì)胞表面NKG2D分子比例增加。2.體外實驗表明,培養(yǎng)成熟的CIK細(xì)胞對普通腫瘤細(xì)胞具有較明顯的殺傷作用,且殺傷效應(yīng)與CIK細(xì)胞呈劑量梯度關(guān)系,作用比例越大,其抑瘤效果更明顯。3.CIK細(xì)胞處理后,HCC遷移侵襲能力下降,同時兩個HCC細(xì)胞株成球能力均有不同程度下降。而腫瘤成球能力是反映腫瘤中干細(xì)胞含量多少的一個重要指標(biāo),且通過直觀觀察腫瘤球與CIK細(xì)胞之間的相互作用也可以發(fā)現(xiàn),CIK可以趨向并攻擊腫瘤球。間接反映出,CIK細(xì)胞有可能對肝癌干細(xì)胞也有一定的殺傷作用。4.利用GFP標(biāo)記Nanog表達(dá)后分選得到的GFP陽性細(xì)胞具有較強的干性特征,包括干性基因上調(diào)、成球能力、遷移侵襲能力增強等；5.體外實驗證實,CIK細(xì)胞對這部分以GFP陽性為代表的腫瘤干細(xì)胞同樣具有較強的殺傷效應(yīng)。6. NOD/SCID小鼠體內(nèi)實驗證實,CIK細(xì)胞不僅能抑制腫瘤增殖,且對干細(xì)胞也具有殺傷效用。7.目前,CIK細(xì)胞抗瘤作用的機制尚未十分明確。我們通過體外實驗證實,CIK細(xì)胞可通過表面NKG2D分子與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)配體結(jié)合后殺傷靶細(xì)胞。而這也可能是CIK細(xì)胞殺傷腫瘤干細(xì)胞的一個重要機制。同時,CIK細(xì)胞還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,包括GFP陽性具有干性特征的腫瘤干細(xì)胞。CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后能分泌大量的IFN-γ從而起到抑瘤效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：1958022