本文選題：CRYAB基因 + 慢病毒��； 參考：《蘭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的本研究采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),通過體外實(shí)驗(yàn)研究CRYAB(alphaβ-crystallin,晶狀體蛋白αβ)基因沉默對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖與遷移能力的影響。方法1.構(gòu)建靶向CRYAB基因特異性shRNA慢病毒載體并轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞株,熒光顯微鏡觀察拍照檢測轉(zhuǎn)染效率;2.Real-time PCR和Western Blotting方法檢測沉默CRYAB基因后CRYAB的mRNA和蛋白質(zhì)水平;3.CCK-8法與細(xì)胞克隆球形成實(shí)驗(yàn)檢測沉默CRYAB基因后細(xì)胞的增殖活性;4.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測沉默CRYAB基因后細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果1.熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,感染復(fù)數(shù)(MOI)值為20的SGC-7901細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染率大于80%;2.Real-time PCR與Western Blotting結(jié)果顯示,成功轉(zhuǎn)染sh RNA-CRYAB胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞株。慢病毒轉(zhuǎn)染72h后,與sh-ctrl組比較,sh-CRYAB組CRYAB mRNA水平減少90%;與sh-ctrl組比較,sh-CRYAB組CRYAB的蛋白表達(dá)顯著降低(P0.001);3.細(xì)胞克隆球形成實(shí)驗(yàn)顯示,SGC7901細(xì)胞感染shRNA慢病毒的細(xì)胞克隆數(shù)明顯較感染對照慢病毒組的克隆數(shù)少,兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4.CCK-8檢測結(jié)果顯示,SGC-7901細(xì)胞的增殖能力于CRYAB基因沉默之后顯著減弱。與sh-ctrl組相比,sh-CRYAB組細(xì)胞增長速度變緩,在第4天、第5天增殖能力降低(P0.05,P0.01)。5.Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染CRYAB shRNA SGC-7901細(xì)胞的遷移能力明顯下降。sh-CRYAB組平均穿膜細(xì)胞數(shù)是(49.5±2.0),sh-ctrl組平均穿膜數(shù)為(370.0±2.9),兩組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P0.01);6.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,sh-ctrl組劃痕基本被遷移的細(xì)胞覆蓋,sh-CRYAB組的劃痕仍比較清楚,測量兩組0、24、48、72 h的相對空白面積,sh-CRYAB組細(xì)胞相對空白面積在24、48、72 h小于sh-ctrl組(P0.01)。結(jié)論shRNA-CRYAB慢病毒干擾載體對抑制CRYAB基因于胃癌細(xì)胞SGC-7901中發(fā)生機(jī)制具有顯著作用,進(jìn)一步使細(xì)胞增殖與遷移受到抑制。CRYAB有望成為腫瘤基因治療的新靶向分子。
[Abstract]:Objective to study the effect of CRYAB (alpha beta -crystallin, crystallin alpha beta) gene silencing on the proliferation and migration of gastric cancer cell SGC-7901 in vitro by using lentivirus mediated RNA interference. Method 1. construction of targeted CRYAB gene specific shRNA lentivirus carrier and transfection of human gastric cancer cell SGC-7901 cell lines. The transfection efficiency was detected by microscope, and the mRNA and protein levels of CRYAB after the silent CRYAB gene were detected by 2.Real-time PCR and Western Blotting. The proliferation activity of the cells after the silencing of the CRYAB gene was detected by the 3.CCK-8 method and the cell cloned ball formation test, and the 4.Transwell Migration Experiment and the cell scratch test were used to detect the silenced CRYAB gene. Results 1. fluorescence microscopy showed that the virus transfection rate of SGC-7901 cells with complex number (MOI) value of 20 was more than 80%. The results of 2.Real-time PCR and Western Blotting showed that the SGC-7901 cell line of SH RNA-CRYAB gastric cancer cells was successfully transfected. Compared with group sh-ctrl, the protein expression of CRYAB in group sh-CRYAB was significantly lower than that in group sh-ctrl (P0.001), and the 3. cell cloned ball formation experiment showed that the number of clones of SGC7901 cells infected with shRNA lentivirus was less than that of the infection control lentivirus group, and the two groups were statistically significant (P0.05); 4.CCK-8 detection results showed SGC-7901 fine. The cell proliferation ability decreased significantly after the CRYAB gene silencing. Compared with the sh-ctrl group, the cell growth rate of sh-CRYAB group slowed, and the proliferation ability decreased on the fourth day, fifth days (P0.05, P0.01).5.Transwell cell migration experiment showed that the transfer ability of CRYAB shRNA SGC-7901 fine cell decreased significantly in the.Sh-CRYAB group. The number of cells was (49.5 + 2), the average membrane number of the sh-ctrl group was (370 + 2.9), and the two groups had statistical difference (P0.01). The results of the 6. cell scratch test showed that the scratches in the sh-ctrl group were basically covered by the migrated cells, the scratches in the sh-CRYAB group were still clearer, the relative blank area of the two groups of 0,24,48,72 h was measured, and the cells of the sh-CRYAB group were relatively blank. The area of 24,48,72 h is less than group sh-ctrl (P0.01). Conclusion shRNA-CRYAB lentivirus interference carrier plays a significant role in the mechanism of inhibiting the occurrence of CRYAB gene in gastric cancer cell SGC-7901. The further inhibition of cell proliferation and migration is expected to be a new target for tumor gene therapy.
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1956741