本文選題：長鏈非編碼RNA + 內(nèi)源競爭性RNA�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：最新的研究顯示2015年男性前列腺癌的發(fā)生率已達26%,預計的死亡率更高達9%。成為繼肺癌后排名第二位的致死性腫瘤。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個非常復雜和動態(tài)變化的過程,包括了多種基因的變化。人類基因組中具有能夠編碼能力的基因有20000個,在2007年,發(fā)現(xiàn)了在多種生物過程中有著起重要作用的非編碼RNA。能夠在多種生物學過程中起到重要作用。在不同種屬中的很多長鏈非編碼RNA能夠最大限度的改變我們對于細胞生物的理解,特別是在對于病理性疾病的認識上,以腫瘤性疾病最為突出。早期lnc RNA能夠在腫瘤發(fā)生中起到非常重要的作用。已經(jīng)在前列腺癌中報道過的長鏈非編碼RNA非常多,包括PCA3,PCAT-1,PCAT-29,PCGEM1,PRNCR1以及CTBP1-AS,這些都是已經(jīng)報道在前列腺癌中發(fā)揮重要作用的長鏈非編碼RNA。我們已經(jīng)知道前列腺癌的所有階段都是依賴AR信號通路起作用的。并且依賴其增殖和存活。雄激素介導的長鏈非編碼RNA在前列腺癌中的作用是非常重要的。前期我們通過RNA-Seq對14對前列腺癌及其癌旁組織進行RNA深度測序,首次發(fā)現(xiàn)the prostate cancer up-regulated long non-coding RNA1(Plnc RNA-1)在前列腺癌組織中表達普遍高于癌旁組織,提示Plnc RNA-1可能在PCa的進展中起到重要作用。此后,我們運用si RNA技術干擾Plnc RNA-1后,細胞中雄激素受體AR表達量明顯降低,細胞的增殖、遷移均下降,并且促進其凋亡,但其與雄激素受體(AR)相互調(diào)節(jié)的具體機制未明。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定過表達及干擾Plnc RNA-1的前列腺癌細胞株,并在細胞水平及動物水平明確了其促癌的功能。運用了Real-time PCR及Northern blot鑒定了Plnc RNA-1的優(yōu)勢剪切體,以及運用原位雜交實驗以及核質(zhì)分離實驗檢測了Plnc RNA-1在細胞中的定位,運用mi Randa預測軟件進行靶向Plnc RNA-1的mi RNA的預測,然后用雙熒光素酶報告基因檢測試驗驗證,發(fā)現(xiàn)能與Plnc RNA-1相互作用的mi R-34c-5p,以及mi R-297-3p,并應用Real-time PCR發(fā)現(xiàn)這兩個mi RNA同樣能靶向AR,并在體外水平研究了這兩個mi RNA在對前列腺癌細胞的增殖以及凋亡的作用,并檢測在人前列腺癌組織中Plnc RNA-1以及這兩個mi RNA的表達量并分析其相關性。本研究將穩(wěn)定過表達及干擾Plnc RNA-1的前列腺癌細胞株在裸鼠上進行荷瘤,發(fā)現(xiàn)其促癌作用體內(nèi)及體外一致。進一步機制研究表明Plnc RNA-1的優(yōu)勢功能剪切體為最短的一條(V3),并且其主要富集在胞質(zhì),通過mi Randa預測軟件進行Plnc RNA-1靶位點的預測,本研究為其篩到了能與之相互作用的mi R-34c-5p以及mi R-297-3p,并且發(fā)現(xiàn)這兩個mi RNA能與雄激素受體作用,并且能抑制前列腺細胞的增殖以及促進其凋亡,與Plnc RNA-1的作用相反。同時在人前列腺癌與癌旁組織中發(fā)現(xiàn)Plnc RNA-1在癌組織中的表達量與這兩個mi RNA的表達是呈現(xiàn)負相關的,與AR是呈現(xiàn)正相關的,并在前列腺癌病人的血漿中檢測到這條lnc RNA的表達量是高于非前列腺癌病人。本研究證實Plnc RNA-1作為內(nèi)源競爭性RNA(ce RNA),通過抑制mi R-34c-5p,mi R-297-3p來促進AR的表達,從而促進前列腺癌的進展,首次報道前列腺癌中的長鏈非編碼RNA能作為ce RNA與雄激素受體作用的機制,并提示了Plnc RNA-1可能作為前列腺癌治療的一個潛在靶點以及可能作為診斷前列腺癌的生物標志物。第一部分長鏈非編碼RNA Plnc RNA-1的鑒定方法:(1)通過UCSC基因數(shù)據(jù)庫顯示Plnc RNA-1的具體基因定位及轉(zhuǎn)錄剪切體。(2)利用RT-PCR和Nothern blot進行Plnc RNA-1剪切體的的檢測,并且在泌尿系統(tǒng)腫瘤細胞系中進行檢測。(3)利用FISH和核質(zhì)分離實驗對Plnc RNA-1進行細胞定位。(4)利用RT-PCR和Western Blot對Plnc RNA-1和AR的關系進行驗證。(5)通過RIP實驗驗證Plnc RNA-1和AR是否直接結(jié)合。結(jié)果:(1)發(fā)現(xiàn)Plnc RNA-1共有三條轉(zhuǎn)錄剪切體,而且長度各異,分別是CBR3-AS1v1(1575bp),CBR3-AS1 v2(1500bp)以及CBR3-AS1 v3(743bp)。(2)發(fā)現(xiàn)v3是前列腺癌中表達最高的,也是之前報道過有功能的Plnc RNA-1.并且在泌尿系統(tǒng)腫瘤細胞系中表達量最高。(3)FISH和核質(zhì)分離實驗發(fā)現(xiàn)Plnc RNA-1主要位于細胞質(zhì)。(4)在LNCa P和22RV1細胞中干擾Plnc RNA-1后,AR m RNA及蛋白的表達是下調(diào)的。過表達Plnc RNA-1后,AR m RNA及蛋白的表達是上調(diào)的。(5)RIP實驗驗證Plnc RNA-1和AR不能結(jié)合。結(jié)論:Plnc RNA-1是CBR3-AS1 v3,主要位于細胞質(zhì),能夠調(diào)控AR的表達,但是不能與AR直接結(jié)合。第二部分:AR對長鏈非編碼RNA Plnc RNA-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用研究方法:(1)通過在LNCa P細胞中添加10n M DHT后檢測不同時間Plnc RNA-1的表達量。同時以不同濃度梯度的DHT,分別是0,0.01,1,10,100n M的雄激素去刺激LNCa P細胞48h后,檢測Plnc RNA-1的表達量。(2)同時利用干擾RNA,在LNCa P中干擾AR,檢測Plnc RNA-1的表達。(3)構(gòu)建Plnc RNA-1的啟動子到報告基因上,并用雄激素及雄激素拮抗劑加入到細胞中檢測報告基因的活性。(4)通過PROMO預測軟件預測Plnc RNA-1啟動子上是否有AR的結(jié)合位點,并利用染色體免疫共沉淀實驗驗證Plnc RNA-1的啟動子能與AR是否結(jié)合。結(jié)果:(1)發(fā)現(xiàn)加入DHT后,LNCa P細胞中的Plnc RNA-1的表達量隨著時間是上調(diào)的,加入不同濃度的DHT刺激LNCa P后,發(fā)現(xiàn)Plnc RNA-1的表達量也是隨著濃度的增加而不斷上調(diào)。(2)在LNCa P細胞中干擾AR后,發(fā)現(xiàn)Plnc RNA-1的表達也是下調(diào)的。(3)加入雄激素后,報告基因的活性是上調(diào)的,加入雄激素抑制劑后,報告基因的活性是下調(diào)的。(4)通過PROMO預測軟件預測出在Plnc RNA-1的啟動子上游1500bp的區(qū)域有三個預測位點。同時通過CHIP驗證出了這三個位點確實能與AR結(jié)合。結(jié)論:體外實驗證實長鏈非編碼Plnc RNA-1是AR啟動的長鏈非編碼RNA。第三部分:Plnc RNA-1促進AR表達上調(diào)的內(nèi)源性競爭RNA機制研究方法:(1)生物信息學分析篩選出靶向Plnc RNA-1的mi RNA。(2)利用干擾RNA技術干擾Plnc RNA-1后,RT-PCR檢測篩選出的mi RNA的表達,初步篩選出與Plnc RNA-1作用的mi RNA.(3)通過在LNCa P細胞中轉(zhuǎn)染mi R-297-3p,mi R-34c-5p mimics驗證是否能與Plnc RNA-1和AR相互作用。(4)通過生物信息學將這兩條mi RNA靶向AR3’UTR的區(qū)域進行了匹配,并將片段構(gòu)建報告基因,驗證篩選出的mi RNA是否能作用使其熒光活性降低(5)利用mi RNA作用位點突變實驗研究mi RNA對于Plnc RNA-1的影響是否依賴于與mi RNA的結(jié)合位點。(6)RNA免疫共沉淀研究Plnc RNA-1與mi RNA是否直接結(jié)合Ago2,參與RISC復合物,競爭實驗驗證Plnc RNA-1是否與AR相互競爭。(7)RNA免疫共沉淀研究Plnc RNA-1是否與mi RNA直接結(jié)合。結(jié)果:(1)生物信息學分析篩選出13條靶向Plnc RNA-1的mi RNA。(2)干擾Plnc RNA-1后,進一步篩選出mi R-297-3p和mi R-34c-5p為能于Plnc RNA-1相互作用的mi RNA。(3)mi R-297-3p和mi R-34c-5p能夠影響AR3’UTR以及Plnc RNA-1野生型片段的活性,但不能影響突變掉mi RNA結(jié)合位點的Plnc RNA-1片段的活性。(4)RNA免疫共沉淀證實Plnc RNA-1與mi R-34c-5p以及mi R-297-3p直接結(jié)合到Ago2,并且能與AR互相競爭。(5)RNA免疫共沉淀實驗證實Plnc RNA-1與mi RNA直接結(jié)合結(jié)論:體外實驗證實長鏈非編碼RNA Plnc RNA-1能夠上調(diào)AR,mi RNA參與Plnc RNA-1對AR的調(diào)控過程。第四部分:Plnc RNA-1促進前列腺癌細胞增殖,遷移和凋亡抵抗的作用分析方法:(1)CCK-8細胞活性檢測試劑盒檢測Plnc RNA-1對于前列腺癌細胞的增殖影響。凋亡試劑盒檢測Plnc RNA-1對于前列腺癌細胞的凋亡影響。Transwell實驗檢測Plnc RNA-1對于前列腺癌細胞的遷移能力影響。細胞周期試劑盒檢測Plnc RNA-1對于前列腺癌細胞的周期影響。(2)檢測mi R-297-3p以及mi R-34c-5p對于前列腺癌細胞的增殖,凋亡影響。(3)在LNCa P細胞中通過轉(zhuǎn)染過表達慢病毒(LV-Plnc RNA-1)過表達Plnc RNA-1,以及干擾慢病毒(LV-si Plnc RNA-1)體內(nèi)實驗研究Plnc RNA-1促癌的作用,并且也在22RV1細胞中檢驗。(4)在裸鼠荷瘤上檢測Plnc RNA-1在體內(nèi)對AR以及相應mi RNA的影響。結(jié)果:(1)CCK-8細胞活性檢測試劑盒及細胞周期試劑盒發(fā)現(xiàn)Plnc RNA-1能夠促進前列腺癌細胞增殖。凋亡試劑盒檢測Plnc RNA-1能夠減少前列腺癌細胞凋亡.Transwell實驗能夠促進前列腺癌細胞遷移,并且這些效應的產(chǎn)生依賴于AR的介導。(2)通過增殖,凋亡檢測mi R-297-3p以及mi R-34c-5p對前列腺癌細胞的影響,發(fā)現(xiàn)其效應與Plnc RNA-1效應相反。(3)在LNCa P細胞中過表達Plnc RNA-1以及干擾Plnc RNA-1后,將細胞荷瘤于裸鼠上發(fā)現(xiàn),過表達Plnc RNA-1組與對照組相比,瘤子體積明顯增大,干擾Plnc RNA-1組與對照組比,瘤子體積明顯減小,同樣效應在22RV1細胞中也有。(4)通過檢測荷瘤里面的Plnc RNA-1,AR以及相應mi RNA的變化,發(fā)現(xiàn)過表達Plnc RNA-1后,AR有明顯上調(diào),mi R-297-3p和mi R-34c-5p是相應下調(diào)的,干擾Plnc RNA-1后,AR是明顯下調(diào)的,mi R-297-3p和mi R-34c-5p是相應上調(diào)的。結(jié)論:通過增殖,凋亡,周期表明Plnc RNA-1能為前列腺癌細胞的癌基因。與其相互作用的mi R-297-3p以及mi R-34c-5p可能為前列腺癌細胞的抑癌基因,兩者在體內(nèi)的效應也是互相抑制。第五部分:Plnc RNA-1相關基因在前列腺癌臨床病理診斷中的意義研究方法:(1)通過RT-PCR檢測16對前列腺癌組織以及癌旁組織中Plnc RNA-1以及相應mi RNA的表達。并利用原位雜交驗證Plnc RNA-1以及相應mi RNA在前列腺癌組織中的表達。并通過RT-PCR檢測48個前列腺癌組織中Plnc RNA-1相關基因的表達(2)通過RT-PCR檢測37個穿刺陽性的前列腺癌病人以及35個穿刺陰性的血里面的Plnc RNA-1的含量。結(jié)果:(1)通過檢測16對配對的癌與癌旁中Plnc RNA-1,mi R-297-3p,mi R-34c-5p的表達,發(fā)現(xiàn)Plnc RNA-1與mi R-297-3p以及mi R-34c-5p的表達是呈負相關。進一步檢測48個前列腺癌組織中Plnc RNA-1,AR,mi R-297-3p,mi R-34c-5p的表達,發(fā)現(xiàn)Plnc RNA-1與AR是正相關,與Bcl-x L基因也是正相關,與mi R-297-3p以及mi R-34c-5p是負相關。(2)通過檢測37個穿刺陽性的前列腺癌病人以及35個穿刺陰性的血里面的Plnc RNA-1的含量,發(fā)現(xiàn)穿刺陽性Plnc RNA-1的含量是明顯高于穿刺陰性的病人。結(jié)論:前列腺癌病人組織中確實有Plnc RNA-1表達的上調(diào),相應mi R-297-3p以及mi R-34c-5p的變化。前列腺癌病人的血中也能檢測到Plnc RNA-1的存在,并且可能成為診斷前列腺癌的生物標志物。小結(jié)本論文中,主要針對前列腺癌發(fā)生發(fā)展中關鍵的長鏈非編碼RNA進行功能及作用機制的研究。通過構(gòu)建Plnc RNA-1的過表達及干擾的細胞系,并在細胞水平及動物水平證實其促癌的功能,在機制研究中,通過多種策略系統(tǒng)性的研究了Plnc RNA-1的優(yōu)勢剪切體,胞內(nèi)定位。提示了其在胞漿中穩(wěn)定存在并有可能發(fā)揮調(diào)控作用。進一步的生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因驗證發(fā)現(xiàn)了Plnc RNA-1可以直接作用于mi R-34c及mi R-297,并通過靶基因預測和相關研究證實了兩個mi RNA可以靶向AR,同時證明了mi RNA在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中同時具有作用。最終在體內(nèi)樣本中證實Plnc RNA-1與兩個mi RNA的相關性,綜合全論文,在此前發(fā)現(xiàn)AR調(diào)控Plnc RNA-1的基礎上,本文系統(tǒng)性地證實了Plnc RNA-1通過靶向吸附mi RNA調(diào)控AR的內(nèi)源性競爭性mi RNA的海綿機制,從而描述了AR-Plnc RNA-1之間形成的正反饋促進機制,對于認識AR相關的前列腺癌發(fā)生具有重要意義。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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本文編號：1955462