本文選題：procaspase-8 + TRAIL��； 參考：《昆明理工大學》2015年碩士論文

【摘要】：TRAIL ((Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體)屬于TNF-α相關(guān)細胞因子家族成員,并因其選擇性抗腫瘤且對正常細胞無毒性的特點,使其成為腫瘤治療的潛力藥物。AT-406是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Proteins, IAPs)的一種泛拮抗劑。Rocaglamide是從楝科米仔蘭屬中分離得到的天然化合產(chǎn)物,并被證明它能從翻譯水平抑制c-FLIP(Cellular Fadd-Like (Flice)-Inhibitory Protein)的表達,而c-FLIP被證實能夠競爭性阻斷TRAIL凋亡通路。在我們的研究中,發(fā)現(xiàn)大部分實體瘤細胞系對ART(AT-406(A), Rocaglamide (R)和TRAIL (T))聯(lián)合用藥方式敏感。我們發(fā)現(xiàn),ART聯(lián)合用藥方式能夠有效地誘導大部分實體瘤細胞系凋亡,但對一株乳腺癌細胞系MCF-7,幾株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(U251, U373, U87)以及人體正常牙髓細胞(Pulp)沒有誘導凋亡的作用。在本篇研究中,我們進—步證實在這些對ART聯(lián)合用藥極為耐受的細胞中,除了c-FL IP和IAPs這些抑凋亡蛋白有很高的表達量,procaspase-8的表達水平非常低,而其是激活TRAIL凋亡通路的上游蛋白。上調(diào)這些細胞中的procaspase-8蛋白表達量能夠提高這些細胞對ART聯(lián)合用藥方式的敏感性。在此研究中,我們利用MTT細胞活性檢測技術(shù)以及Western Blots技術(shù)分析TRAIL所誘導的外源性凋亡通路中的各個蛋白表達水平。通過這些方法來研究ART聯(lián)合用藥方式所誘導的凋亡效率。實驗結(jié)果顯示乳腺癌細胞系MCF-7,幾株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞及正常牙髓細胞pulp都對ART聯(lián)合用藥方式表現(xiàn)出極強的耐性。通過、Vestern Blots蛋白分析發(fā)現(xiàn),這些細胞中procaspase-8表達水平非常低,但凋亡通路中的其他蛋白的表達水平卻很高,包括死亡受體DR4/5,Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域FADD, c-FLIP和XIAP。我們通過利用Dup-697(一種COX-2的抑制劑),丙戊酸鈉(一種去乙酰化酶抑制劑)以及5-氮雜-2’-脫氧胞苷(一種甲基化酶抑制劑)來預處理這些細胞,提高procaspase-8蛋白在這些細胞中的表達水平,提高了ART聯(lián)合用藥方式對這些細胞的促凋亡率。總體來說,我們的實驗數(shù)據(jù)證明了ART聯(lián)藥方式有效地誘導大部分實體瘤細胞系的凋亡。但有部分的實體瘤細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞仍對ART聯(lián)藥方式有很高的耐性。上調(diào)procaspase-8的表達量可以提高凋亡率。同時,人正常牙髓細胞也表現(xiàn)出對ART聯(lián)合用藥很高的耐性,提高牙髓細胞中procaspase-8的表達量可以提高聯(lián)合用藥對其凋亡率。提示我們的ART聯(lián)合用藥方式對人正常細胞沒有毒性,而其原因可能就是procaspase-8的低表達。因此,我們認為這些腫瘤細胞系和人正常牙髓細胞能夠逃逸凋亡的機制在于procaspase-8的低表達水平,procaspase-8在TRAIL凋亡過程必不可少。探究procaspase-8的主要異常情況,為未來以TIAIL為基礎(chǔ)的癌癥治療方法提供進一步的治療策略。
[Abstract]:TRAIL Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) is a member of TNF- 偽 associated cytokine family. AT-406 is a pan-antagonist of apoptosis inhibitor of Apoptosis Proteins, IAPs). Rocaglamide is a natural compound isolated from the genus Melia, and has been shown to inhibit the expression of c-FLIP(Cellular Fadd-Like Flicesis-Inhibitory protein at translation level. C-FLIP has been proved to be able to competitively block TRAIL apoptosis pathway. In our study, it was found that most solid tumor cell lines were sensitive to the combination of ARTI-AT-406A (Rocaglamide) and TRAIL (TX). We found that the combined use of art can effectively induce apoptosis in most solid tumor cell lines, but it has no effect on one breast cancer cell line MCF-7, several glioma cell lines U251, U373, U87) and pulp cells of human normal dental pulp. In this study, we further demonstrated that in these cells that are extremely resistant to ART combination, the expression of proc caspase-8, in addition to c-FL IP and IAPs, is very low. It is the upstream protein that activates the apoptosis pathway of TRAIL. Upregulating the expression of procaspase-8 protein in these cells increased the sensitivity of these cells to the combination of ART. In this study, we analyzed the expression levels of various proteins in exogenous apoptotic pathway induced by TRAIL by MTT assay and Western Blots technique. These methods were used to study the apoptotic efficiency induced by the combination of ART. The results showed that the breast cancer cell line MCF-7, several glioma cells and normal dental pulp cell line pulp all showed strong tolerance to the combination of ART. Vestern Blots protein analysis showed that the expression of procaspase-8 was very low in these cells, but the expression of other proteins in apoptosis pathway was very high, including FADDD, c-FLIP and XIAPs associated with death receptor DR4 / 5Fas. We pretreated these cells with Dup-697, an inhibitor of COX-2, sodium valproate (a deacetylase inhibitor) and 5-aza-2-deoxycytidine (a methylase inhibitor). The expression of procaspase-8 protein in these cells was increased, and the apoptotic rate of these cells was increased by the combination of ART. In general, our experimental data demonstrate that ART-combined drugs can effectively induce apoptosis in most solid tumor cell lines. However, some solid tumor cells and glioma cells still have high tolerance to ART combination. Upregulation of procaspase-8 expression can increase apoptosis rate. At the same time, human normal dental pulp cells also showed a high tolerance to combined use of ART. Increasing the expression of procaspase-8 in dental pulp cells could increase the apoptosis rate of combined treatment. The results suggest that our combined use of ART has no toxicity to human normal cells, which may be due to the low expression of procaspase-8. Therefore, we believe that the mechanism that these tumor cell lines and human normal dental pulp cells can escape apoptosis lies in the low expression level of procaspase-8 in the process of TRAIL apoptosis. Explore the main abnormalities of procaspase-8 and provide further strategies for future TIAIL-based cancer treatment.
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R73-36

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本文編號：1949587