發(fā)布時間：2018-05-25 05:22

  本文選題：黑色素瘤 + 線形程序性壞死　； 參考：《天津醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：研究目的黑色素瘤是具有雙向分化能力的惡性腫瘤。Maniotis等人在研究黑色素瘤時發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)現(xiàn)象。VM是腫瘤特有的血液供應模式,VM由腫瘤細胞和PAS陽性物質(zhì)圍成的管腔,內(nèi)含紅細胞。本課題組在大量的臨床組織標本的觀察中發(fā)現(xiàn)了線性程序性壞死(linearly patterned programmed cell necrosis,LPPCN)這一特殊的細胞死亡模式。LPPCN是腫瘤細胞群體主動發(fā)生的、沒有炎癥細胞浸潤的死亡模式。前期實驗結(jié)果證實LPPCN的存在促進VM的形成,其消亡而殘留的空間可能為血管生成擬態(tài)和內(nèi)皮依賴性血管(endothelium dependent vessel,EDV)的形成提供空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本課題收集135例黑色素瘤組織標本,探討黑色素瘤中LPPCN、VM的現(xiàn)象及其形成機制。研究方法1.收集135例人黑色素瘤組織標本,運用HE染色及、CD34/PAS雙重染色、c-myc的表達情況方法分別檢測黑色素瘤組織中LPPCN和VM的情況,并初步分析其與黑色素瘤患者臨床病理參數(shù)、患者生存預后的關(guān)系。2.運用MTT增殖實驗,Matrigel三維培養(yǎng),侵襲、遷移實驗,劃痕實驗,分別檢測c-myc對黑色素瘤細胞增殖能力,管道形成能力,侵襲、遷移能力,傷口愈合能力的影響。運用Western Blot,RT-PCR,熒光素酶報告基因和免疫共沉淀方法等方法檢測c-myc轉(zhuǎn)染效果及其對Snail,VE-cadherin蛋白表達的影響。3.運用Annexin V-FITC/Propidium Iodid凋亡實驗和流式細胞術(shù),檢測c-myc對黑色素瘤細胞的促凋亡作用。并使用Western Blot,si RNA實驗檢測c-myc對凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Bax的影響。4.利用不同濃度Cocl2體外模擬細胞的梯度缺氧。使用RT-PCR和Western Blot檢測各細胞中HIF-1α、Bcl2、Bax基因及蛋白表達變化,并觀察Bcl2/Bax比值的變化。5.運用裸鼠動物模型,再次驗證c-myc對黑色素瘤的作用。運用HE染色、Endomucin/PAS雙染檢測移植瘤內(nèi)c-myc對LPPCN和VM的影響;運用免疫組化方法檢測VM、凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。6.建立細胞球石蠟包埋方法。鼠源黑色素瘤細胞系B16F10細胞球培養(yǎng),石蠟包埋,HE染色,觀察細胞球中程序性壞死現(xiàn)象。B16F10細胞球在C57小鼠體內(nèi)培養(yǎng)第5天,將移植瘤取出,石蠟包埋。HE染色觀察LPPCN生成情況。7.無血清懸浮培養(yǎng)法富集黑色素瘤腫瘤干細胞,瓊脂糖懸浮培養(yǎng)黑色素瘤細胞,并石蠟包埋切片HE染色觀察兩組的區(qū)別。Agilent表達譜芯片分析兩者基因表達情況,篩選靶基因進行熒光定量PCR驗證。8.流式細胞分離術(shù)分離高、低表達靶基因的B16F10細胞,Western Blot方法驗證分離效果,并檢測VM形成相關(guān)蛋白E-cadherin、Twist1,VE-cadherin及腫瘤多能干性相關(guān)蛋白Sox2、c-myc的表達情況。9.運用Matrigel三維培養(yǎng),遷移、侵襲實驗,劃痕實驗,檢測靶基因?qū)谏亓黾毎艿佬纬赡芰?侵襲、遷移能力及傷口愈合能力的影響。Western Blot和熒光定量PCR方法檢測VM形成相關(guān)蛋白E-cadherin、Twist1、Vimentin,VE-cadherin和腫瘤多能干性相關(guān)蛋白Sox2、c-myc表達情況。10.使用Notch信號通路抑制劑(γ分泌酶抑制劑DAPT),并使用Western Blot和熒光定量PCR方法檢測靶基因Notch4抑制情況及VM形成相關(guān)蛋白表達情況。再次上調(diào)穩(wěn)定降表達Notch4的黑色素瘤細胞的Twist1表達,Western Blot檢測E-cadherin和VE-cadherin的表達情況。11.收集120例人黑色素瘤病例,免疫組化方法檢測黑色素瘤組織中Notch4蛋白的表達情況,初步分析其與臨床病理參數(shù)、VM之間的關(guān)系。研究結(jié)果1.135例人黑色素瘤組織中LPPCN陽性者48.15%,VM陽性者45.93%。兩者均與腫瘤的Breslow厚度、遠處轉(zhuǎn)移、患者不良預后相關(guān)(p0.05)。人黑色素瘤組織中高表達c-myc者占總數(shù)的48.15%。c-myc高表達與腫瘤的Breslow厚度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及患者不良預后相關(guān)(p0.05)。c-myc高表達與VM、LPPCN成正相關(guān)(p0.05)。2.體外功能實驗結(jié)果顯示c-myc高表達增強A375、MUM-2C細胞的增殖,管道形成,侵襲、遷移能力(p0.05)。c-myc蛋白能夠促進黑色素瘤細胞多向分化:促進間質(zhì)表型Vimentin表達,并通過TGF-β/Snail/E-cadherin信號通路促進黑色素瘤細胞上皮表型丟失;能夠結(jié)合VE-cadherin啟動子并促進其轉(zhuǎn)錄,進而促進VM的形成。3.急性或重度缺氧時c-myc蛋白通過上調(diào)Bax表達,降低Bcl2/Bax比值,進而促進黑色素瘤細胞凋亡。4.動物模型中,下調(diào)c-myc后MUM-2B黑色素瘤移植瘤生長速度減慢,腫瘤體積減少,腫瘤中LPPCN與VM數(shù)量減少(p0.05),E-cadherin表達上調(diào),VE-cadherin、Bax、HIF-1α表達下降;上調(diào)c-myc后MUM-2C黑色素瘤移植瘤腫瘤的生長速度加快,腫瘤體積增加,LPPCN與VM數(shù)量增加(p0.05),E-cadherin、HIF-1α、Bax表達下降,VE-cadherin、Bcl2表達升高,且Bax陽性表達呈線狀排列。5.B16細胞球HE染色發(fā)現(xiàn)細胞球呈現(xiàn)三層結(jié)構(gòu),從內(nèi)向外依次為壞死或?qū)⑺兰毎麑印㈧o止細胞層、增殖細胞層。在細胞球的壞死或?qū)⑺兰毎麑又兴劳龅某尸F(xiàn)核深染、漿濃縮、細胞間連接消失的現(xiàn)象。但無線形或網(wǎng)狀排列的LPPCN。體內(nèi)培養(yǎng)第5天。HE染色見無血管長入的移植瘤內(nèi)有LPPCN樣細胞死亡,但無線形或網(wǎng)狀排列的LPPCN。6.Agilent表達譜芯片結(jié)果顯示黑色素瘤干細胞高表達高表達Sox4(NM_009238),Wnt10a(NM_009518),NGFR(NM_033217)等腫瘤干細胞相關(guān)基因,藥物抗性基因ABCA8(NM_013851)、ABCA1(NM_013454)以及Notch信號通路相關(guān)基因:Notch3(NM_008716)、Notch4(NM_010929)、Dtx4(NM_172442)、JAG2(NM_010588)和Pofut(NM_080463)。熒光定量PCR再次檢測上述基因表達情況。結(jié)果顯示上述10中基因的表達趨勢與芯片結(jié)果一致,且Notch4和NGFR差異具有統(tǒng)計學意義。7.Western Blot結(jié)果顯示流式細胞分選出的Notch4highB16F10細胞高表達Notch4、Jagg2、Twist1、VE-cadherin、Sox2蛋白,低表達E-cadherin蛋白。8.Notch4降表達降低A375、MUM-2B細胞的管道形成,侵襲、遷移,傷口愈合能力(p0.05)。Western Blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示下調(diào)Notch4后,VM形成相關(guān)蛋白Twist1、Vimentin、VE-cadherin的表達下降,和上皮表型蛋白E-cadherin表達的升高。9.Western Blot結(jié)果表明γ分泌酶抑制劑DAPT抑制了Notch4胞內(nèi)段的解離并下調(diào)Twist1表達,同時上調(diào)E-cadherin蛋白的表達。再次上調(diào)穩(wěn)定降表達Notch4的黑色素瘤細胞中Twist1表達后,Western Blot結(jié)果顯示E-cadherin表達降低,VE-cadherin的表達升高。10.120例人黑色素瘤組織中免疫組化結(jié)果顯示72(60%)例黑色素瘤患者中Notch4高表達。Notch4免疫組化染色定位于黑色素瘤細胞漿。Notch4高表達與患者TNM分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,患者不良預后及VM相關(guān)(p0.05)結(jié)論1.人體黑色素瘤組織中存在VM和LPPCN現(xiàn)象,且c-myc在人體黑色素瘤組織中高表達,三者均與黑色素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為和不良預后相關(guān)。c-myc高表達與LPPCN,VM成正相關(guān)。2.c-myc高表達使黑色素瘤細胞上皮表型丟失,間充質(zhì)表型增強,促進黑色素瘤VM的形成;c-myc高表達促進黑色素瘤細胞LPPCN的發(fā)生,進而促進黑色素瘤VM的形成。3.LPPCN的形成與腫瘤血管密切相關(guān)。4.Notch4在黑色素瘤干細胞中高表達。Notch4通過下調(diào)Twsit1的表達降低黑色素瘤細胞上皮表型,增強間質(zhì)表型,并促進黑色素瘤遷移、侵襲及三維成管能力。人體組織標本中Notch4高表達與黑色素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移,不良預后相關(guān),與VM成正相關(guān)。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of c - myc on proliferation of melanoma cells and to investigate the effect of c - myc on the expression of apoptosis - related protein Bcl - 2 and Bax in melanoma . The expression of Notch4 protein in human melanoma cells was detected by Western Blot and fluorescence quantitative PCR . The expression of Notch4 protein in human melanoma cells was detected by Western Blot . The expression of E - cadherin , E - cadherin , expression of E - cadherin , Bax and HIF - 1偽 decreased , and the expression of E - cadherin , E - cadherin , Bax and HIF - 1偽 was decreased . The results showed that the expression of E - cadherin increased , the expression of E - cadherin , Bax and HIF - 1偽 decreased . The results of Western Blot showed that the expression of E - cadherin decreased and the expression of E - cadherin increased .
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5

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本文編號：1932264