本文選題：肝細(xì)胞癌 + 微血管侵犯　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：【研究背景與目的】肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在全球范圍內(nèi)是第五大常見惡性消化道腫瘤,并且是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的第三大原因,其發(fā)病率和死亡率近年來逐漸上升。目前手術(shù)切除和肝移植被公認(rèn)為是肝細(xì)胞癌最好的治療方法,但由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率,HCC患者的預(yù)后仍然無法令人滿意。肝癌的血管侵犯被認(rèn)為是由腫瘤表達(dá)的一種具有侵略性的生物學(xué)行為,是目前預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)的最關(guān)鍵因素之一。MVI(microvascular Invasion,MVI)作為血管侵犯的一種特殊類型,存在于肝癌發(fā)展過程中一個(gè)特殊的中間階段,其通過侵犯門靜脈或肝靜脈分支形成肝內(nèi)復(fù)發(fā)或全身轉(zhuǎn)移,從而影響患者預(yù)后。然而國際及國內(nèi)諸多學(xué)者對(duì)MVI的定義、分級(jí)尚存在爭議,并且鑒于肝癌MVI在評(píng)價(jià)組織特性、預(yù)后以及治療方面仍存在很大的異質(zhì)性,因而目前對(duì)于MVI的診斷仍然依賴于術(shù)后的病理檢測(cè)。很多研究者從影像學(xué),病理學(xué),血清學(xué)等方面進(jìn)行大量的研究,發(fā)現(xiàn)了很多指標(biāo)均與MVI的發(fā)生相關(guān),但鑒于這些指標(biāo)在MVI的預(yù)測(cè)有效率方面還較低,因而限制了臨床運(yùn)用,探索有效的生物標(biāo)志物提高術(shù)前MVI的預(yù)測(cè)診斷正確率也就成為了目前MVI研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells,CTCs)是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱,因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶滲入到周圍組織脫落到外周血液循環(huán),大部分CTCs會(huì)在機(jī)體的作用下發(fā)生凋亡,少部分能夠逃逸免疫系統(tǒng)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究證實(shí),CTCs存在于惡性腫瘤形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性病灶的中間過程,與患者的臨床預(yù)后關(guān)系密切相關(guān),可以成為預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的一個(gè)較為可靠的輔助因子,甚至有研究者提出將CTCs檢測(cè)加入到現(xiàn)有的肝癌臨床分期指標(biāo),進(jìn)而提高肝臟腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的預(yù)后評(píng)估能力。近年來,伴隨著生物研究技術(shù)的進(jìn)步,外周血中CTCs的富集、分離、鑒定技術(shù)逐漸建立成熟。本實(shí)驗(yàn)室通過前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)肝癌CTCs檢出和CTCs個(gè)數(shù)與肝臟腫瘤直徑大小、是否發(fā)生大血管侵犯(門靜脈癌栓)、TNM的臨床分期等均緊密相關(guān),并且研究表明CTCs影響HCC術(shù)后患者的預(yù)后。但關(guān)于CTCs與血管侵犯的另一特殊類型MVI兩者之間是否具有相關(guān)性,目前還尚未有相關(guān)報(bào)道。因此我們就CTCs與MVI之間是否具有相關(guān)性展開了進(jìn)一步深入研究。在本研究我們進(jìn)一步優(yōu)化了的肝癌CTCs分離和鑒定技術(shù),在分離方面運(yùn)用Ficoll密度梯度離心結(jié)合磁性激活細(xì)胞分選術(shù)(Magnetic activated cell separation,MACS)富集肝癌CTCs,通過標(biāo)記CD45單克隆抗體的免疫磁珠陰性分選去除肝癌患者外血液中的淋巴細(xì)胞。陰性分選法與陽性分選法相比降低了腫瘤特異性對(duì)富集CTCs的影響。在選取進(jìn)一步鑒定肝癌CTCs的標(biāo)志物方面,我們嘗試了很多指標(biāo),發(fā)現(xiàn)有肝癌細(xì)胞特異性表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor,ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1(Carbamy phosphate synthetase 1,CPS1)的混合指標(biāo)在鑒定肝癌CTCs方面特異性及敏感性都較高。經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,建立多色免疫熒光染色方法后,我們采集HCC患者的外周血液檢測(cè)術(shù)前CTCs,并通過術(shù)后病理HE染色確定是否發(fā)生MVI,最終結(jié)合臨床病理資料,探討CTCs在術(shù)前肝癌MVI預(yù)測(cè)運(yùn)用中的臨床價(jià)值,以期為后續(xù)進(jìn)一步研究針對(duì)肝癌CTCs及MVI的個(gè)體化治療提供了理論依據(jù)。【研究方法】1.建立多色細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)富集、分離、鑒定、計(jì)數(shù)肝癌CTCs:采集所有患者5m L外周血(采用含EDTA的5m L抗凝管),通過Ficoll-Paque PLUS分離液進(jìn)行密度梯度離心后,用磁性標(biāo)記的抗CD45單克隆抗體提取表達(dá)CD45的白細(xì)胞來富集肝癌CTCs。用離心涂片機(jī)將富集到的細(xì)胞分在多聚賴氨酸玻片上制成細(xì)胞涂片,人去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor,ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1(carbamoyl phosphate synthetase 1,CPS1)小鼠單克隆抗體和大鼠抗人CD45單克隆抗體的混合物共孵育,再用兔抗小鼠-Alexa Fluor647 Ig G,山羊抗大鼠-Cy3作為二抗孵育,隨后用DAPI染色。通過熒光顯微鏡評(píng)估染色的載玻片。ASGPR+CPS1陽性,DAPI陽性,CD45陰性,且符合形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞記為CTCs。采用上述方法檢測(cè)108例肝癌患者CTCs表達(dá)情況,并計(jì)數(shù)CTCs。2.病理標(biāo)本HE染色判斷肝癌患者M(jìn)VI發(fā)生:根據(jù)《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015版)》,將MVI定義為顯微鏡下可見的微小靜脈(中央靜脈、門靜脈分支或包膜外小靜脈)內(nèi)漂浮有成團(tuán)癌細(xì)胞且周邊有明確的血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞。對(duì)所有患者腫瘤組織固定,切邊制作成病理切片,對(duì)所有的病理切片進(jìn)行HE染色,通過顯微鏡下觀察,依據(jù)指南鑒別有無MVI發(fā)生。3.統(tǒng)計(jì)分析CTCs與MVI之間的相關(guān)性:收集并統(tǒng)計(jì)肝癌患者臨床及病理資料,對(duì)納入檢測(cè)的108例肝癌患者檢測(cè)、鑒定CTCs并計(jì)數(shù)。連續(xù)變量以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。分類變量表示為頻率和百分比,單因素分析方法采用χ2檢驗(yàn),多因素分析用Logistic回歸分析,以確定與微血管侵犯發(fā)生的獨(dú)立相關(guān)相關(guān)因素,并使用ROC曲線(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC)檢驗(yàn)并比較各因素的臨床效能。以雙側(cè)檢驗(yàn)作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),P0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 18.0軟件�！狙芯拷Y(jié)果】1、ASGPR+CPS1/CD45鑒定指標(biāo)可用于分離、富集、鑒定出樣本中的肝癌CTCs,是一種可靠有效的方法,而基于多色免疫熒光染色技術(shù)建立的CTCs鑒定方法可以用于準(zhǔn)確得判定肝癌CTCs表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果顯示24例肝癌患者中有18例可以檢測(cè)出ASGPR(+)+CPS1(+)/CD45(-)細(xì)胞,檢出率為75%。12例其他惡性腫瘤患者(2例食管癌,2例胃癌,4例膽囊癌,3例結(jié)腸癌和1例乳腺癌)以及10名健康志愿者的外周血中,未檢測(cè)出ASGPR(+)+CPS1(+)/CD45(-)細(xì)胞。2、肝癌患者術(shù)前每5ml血中CTC數(shù)目檢出平均值36±24個(gè)。術(shù)后病理證實(shí)44例HCC患者為MVI(+),其中男性30例,女性14例;64例患者為MVI(-),其中男性41例,女性23例。CTC(+)患者64例,血清AFP400μg/L患者49例,腫瘤直徑5cm的44例,腫瘤數(shù)目單發(fā)的51例,腫瘤多發(fā)的57例�；诟伟┗颊咄庵苎惺欠駲z測(cè)出CTCs將患者分成兩組(CTC(+)和CTC(-)組)�；颊咄庵苎蠧TC(+)與MVI的表達(dá),腫瘤數(shù)目,DCP40m Au/m L及前白蛋白≤170mg/L顯著相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但與其他臨床病理特征沒有顯著相關(guān)性。3、MVI(+)患者44例,CTC(+)檢出33例,檢出率為75%;MVI(-)患者64例,CTC(+)檢出18例,檢出率28%。患者術(shù)前外周血液中的CTC(+)檢出率高于MVI(-)患者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),MVI(+)陽性患者與MVI(-)陰性患者相比,前者發(fā)生CTCs的可能更大。4、將本研究的108例患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行單因素回歸分析,結(jié)果提示:CTC(+),AFP400μg/L,DCP40m Au/m L、腫瘤直徑和腫瘤數(shù)目是MVI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而多因素Logistic回歸分析結(jié)果提示:CTC(+)、AFP400μg/L、DCP40m Au/m L和腫瘤直徑是MVI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。5、為了評(píng)價(jià)各因子的預(yù)測(cè)價(jià)值,使用了ROC曲線來分析他們的靈敏性和特異性。CTC(+)的ROC曲線下面積為0.73,靈敏性為75%,特異性為71.9%,并且其ROC曲線下面積明顯高于單個(gè)因素如:AFP400μg/L,DCP40m Au/m L、腫瘤直徑。此外,CTC(+)、AFP400?g/L、DCP40m Au/m L和腫瘤直徑組合后進(jìn)行多因素分析時(shí)生成的ROC曲線下面積為0.86,靈敏性為84.38%,特異性為72.37%�！狙芯拷Y(jié)論】本研究建立的多色免疫熒光染色方法可靠實(shí)用,可用于肝癌CTCs術(shù)前分離鑒定。HCC患者外周血中檢測(cè)出CTCs與其MVI的發(fā)生密切相關(guān),CTCs能較好的術(shù)前預(yù)測(cè)MVI的發(fā)生,并為后續(xù)進(jìn)一步研究針對(duì)肝癌CTCs及MVI的個(gè)體化治療提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:In recent years , the diagnosis of hepatocellular carcinoma ( MVI ) is considered to be one of the most important factors to predict the prognosis of hepatocellular carcinoma . In this paper , we used Ficoll density gradient centrifugation combined with magnetic activated cell separation ( MACS ) to enrich the CTCs of liver cancer . The expression of CTCs in liver cancer patients was determined by means of fluorescence microscope . The correlation between CTCs and MVI was determined by means of fluorescence microscope . P 0.05 was considered statistically significant , and all statistical analysis was performed with SPSS 18.0 software . The results showed that the detection rate of CTC ( + ) in peripheral blood of patients with liver cancer was significantly higher than that of MVI ( - ) . The results suggested that CTC ( + ) , AFP400渭g / L , DCP40m Au / m L and tumor diameter were independent risk factors of MVI .
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1928765