本文選題：FOXP1基因 + YAP基因��； 參考：《蘇州大學》2015年博士論文

【摘要】：背景肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)(簡稱肝癌)大部分患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期,失去了最佳手術時機,經(jīng)導管肝動脈化療栓塞術(TACE)是目前主要方法,但易致腫瘤的復發(fā)與轉移。原因是化療導致耐藥基因的水平升高,抑癌基因的水平降低,從而導致了腫瘤耐藥性的產(chǎn)生�；谂c這些致癌屬性相關的癌基因而設計的分子靶向藥物在肝癌治療中極具發(fā)展前景。研究表明FOX家族可以促進肝癌細胞的增殖,但機制尚不清楚。YAP是Hippo信號轉導通路下游的效應因子,是重要的癌基因,YAP與腫瘤細胞的增殖和凋亡具有密切的關系,參與肝癌的形成和發(fā)展,前期研究發(fā)現(xiàn)FOXP1和YAP在肝癌組織中高表達,FOXP1和Yes-Associated Protein(YAP)分別與HCC的發(fā)生發(fā)展及預后相關,但是二者在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的關系一直沒有探討。本研究的目的是探討Hippo-YAP信號通路中肝癌相關癌基因FOXP1和YAP在肝癌細胞增殖中的作用,以及以FOXP1-Hippo-YAP作為干預靶標在肝癌分子靶向治療中的潛在價值。第一部分Fox P1和YAP基因在肝癌組織及TACE治療后肝癌組織中的表達目的:用肝癌的基因芯片檢測結果篩選差異表達基因,發(fā)現(xiàn)Fox P1和YAP兩基因在肝癌中的表達情況;經(jīng)TACE后再手術患者組織中FOXP1和YAP表達水平,觀察FOXP1和YAP對肝癌生長能力、侵襲能力、耐藥性是否產(chǎn)生影響,二者之間的關系。方法:用免疫組化(IHC)和免疫印跡(WB)檢測Fox P1蛋白表達,用q PCR檢測Fox P1 m RNA的表達。用realtime q PCR和western blot探討對20例肝癌組織及癌旁組織和20例經(jīng)DDP介入治療再手術的肝癌及癌旁組織中FOXP1和YAP基因表達水平。結果:在肝癌組織中FOXP1m RNA和蛋白表達高于癌旁組織表達,FOXP1在肝癌細胞中的表達與腫瘤大小、血清AFP升高、腫瘤TNM分期顯著相關。YAP在肝癌中過表達高達62%,而癌旁組織中YAP表達水平極低(9%),而FOXP1在肝癌中過表達高達70.18%,而癌旁組織中FOXP1表達水平低(34.58%),FOXP1與YAP蛋白在人肝癌組織中表達的平均光密度值散點圖顯示,兩者呈正相關性,并經(jīng)Pearson相關性分析(r=0.60,P0.0001)。結論:YAP在肝癌中過表達高達62%,而癌旁組織中YAP表達水平極低(9%),而FOXP1在肝癌中過表達高達70.18%,而癌旁組織中FOXP1表達水平低(34.58%),二者表達異常與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。FOXP1在肝癌患者中高表達和區(qū)域淋巴結轉移一樣看做為患者預后的判斷指標。實驗證實在肝癌細胞中抑制內源性YAP和FOXP1表達可以抑制細胞增殖、誘導細胞對化療藥物的敏感性增強、細胞凋亡增多,這表明將FOXP1-Hippo-YAP作為干預靶點具有一定的研究價值。第二部分si RNA敲減YAP基因表達對人肝癌細胞增殖和藥效影響目的:研究小片段干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)抑制肝癌細胞株中Yes-Associated Protein(YAP)表達后從而提高肝癌細胞株對阿霉素(adriamycin,ADM)的化療敏感性。方法:根據(jù)YAP基因設計si RNA序列,利用脂質體LipofectamineTM 2000以si RNA轉染4株肝癌細胞株PLC/PRF/5、Huh-7、MHCC 97H、MHCC 97L,通過熒光顯微鏡觀察及采用蛋白免疫印跡(Western blotting)法檢測肝癌細胞株中YAP的表達。將細胞以不同濃度的ADM作用后,采用四甲基偶氮唑藍(methyl thialzolyl tetrazolium,MTT)比色法檢測細胞生長的存活率。結果:成功地構建針對YAP的si RNA表達載體。Western blotting法結果顯示,肝癌細胞株經(jīng)特異性si RNA轉染后,YAP蛋白的表達受到抑制。RNA干擾(RNA interference,RNAi)能特異、有效地抑制肝癌細胞株中YAP的表達。MTT比色法結果顯示,經(jīng)si RNA作用后肝癌細胞株存活率明顯受到抑制。結論:設計合成的si RNA表達載體能有效地抑制YAP肝癌細胞株中的表達,增強其對化療藥物ADM的敏感性。第三部分 YAP抑制劑PPIX對肝癌細胞株MHCC97L和PLC/PRF/5的體外增殖抑制目的:研究YAP蛋白抑制劑原卟啉IX(Protoporphyrin IX,PPIX)在體外對人肝癌細胞系增殖抑制作用,和PPIX與化療藥物聯(lián)合給藥的協(xié)同作用;以及PPIX對腫瘤細胞Hippo-YAP信號通路和凋亡相關蛋白的表達和激活的影響。方法:用YAP蛋白抑制劑PPIX,以及PPIX和四種藥物(阿霉素,順鉑,氟尿嘧啶和索拉非尼)的聯(lián)合,在體外處理人肝癌細胞系MHCC97L和PLC/PRF/5,利用Celltiter-Glo方法檢測細胞活力,計算不同藥物對腫瘤細胞增殖的抑制率,并計算協(xié)同系數(shù);用Western blot方法檢測YAP抑制劑PPIX和化療藥物的聯(lián)合給藥對人肝癌細胞系Hippo-YAP信號通路和凋亡信號分子表達的影響。結果:10μM的YAP蛋白抑制劑PPIX在體外對兩株人肝癌細胞系MHCC97L和PLC/PRF/5的抑制率分別為42.07%和25.17%;當PPIX和順鉑或者氟尿嘧啶進行聯(lián)合給藥時,具有一定的協(xié)同作用,而PPIX和阿霉素或者索拉非尼進行聯(lián)合給藥時,主要為相加作用,不具有協(xié)同性。PPIX的處理可以下調Fox M1和Fox P1的表達,同時上調自噬相關蛋白Beclin1的表達。結論:YAP蛋白抑制劑PPIX對兩株人肝癌細胞系MHCC97L和PLC/PRF/5都具有一定的體外增殖抑制效果;PPIX和四種藥物聯(lián)合使用,在體外能夠抑制MHCC97L和PLC/PRF/5的增殖,并且具有不同程度的協(xié)同性;PPIX在體外作用于MHCC97L和PLC/PRF/5,能夠抑制Fox M1和Fox P1的蛋白含量;PPIX和四種藥物在體外作用于MHCC97L和PLC/PRF/5,能夠上調自噬基因Beclin1的蛋白含量。第四部分YAP抑制劑PPIX對人肝癌細胞株MHCC97L和PLC/PRF/5荷瘤鼠體內藥效評價目的:建立人肝癌細胞系MHCC97L和PLC/PRF/5的體內移植瘤模型,評價YAP抑制劑PPIX單獨治療、以及PPIX和阿霉素或者順鉑聯(lián)合,對腫瘤體內生長的抑制作用。方法:體外擴大培養(yǎng)人肝癌細胞系MHCC97L和PLC/PRF/5,并接種裸小鼠體內,建立皮下移植瘤模型;當腫瘤生長后,進行分組給藥,評價YAP蛋白抑制劑PPIX第三部分對腫瘤體內生長的抑制作用,以及PPIX和兩個化療藥物(阿霉素和順鉑)的聯(lián)合治療藥效。結果:在MHCC97L細胞的皮下移植腫瘤中,10 mg/kg的PPIX的單獨藥物治療無明顯抑制作用;兩個化療藥物順鉑和阿霉素,其單獨藥物治療不能有效抑制MHCC97L移植瘤的生長;而PPIX和順鉑或者阿霉素的聯(lián)合給藥,也沒有明顯的腫瘤生長抑制作用。在PLC/PRF/5皮下移植瘤中,PPIX和兩個化療藥物順鉑和阿霉素的單獨藥物治療,對腫瘤的生長抑制率(TGI)分別為30.34%,48.20%和66.79%,有一定效果;PPIX和順鉑或者阿霉素的聯(lián)合給藥治療,對腫瘤的生長抑制率分別為57.46%和65.57%,沒有明顯聯(lián)合給藥協(xié)同作用。其中PPIX單獨藥物治療組,以及阿霉素和PPIX聯(lián)合治療組中,各有一只荷瘤鼠出現(xiàn)了腫瘤消退的情況。結論:YAP蛋白抑制劑PPIX進行體內給藥,10 mg/kg給藥劑量對MHCC97L皮下移植腫瘤無明顯抑制效果;YAP蛋白抑制劑PPIX進行體內給藥,10 mg/kg給藥劑量PLC/PRF/5皮下移植腫瘤具有一定體內藥效,同時導致部分腫瘤生長消退。
[Abstract]:The expression of FoxP1 and YAP in hepatocellular carcinoma ( HCC ) was studied by immunohistochemistry ( IHC ) and Western blot . Pearson correlation analysis was performed ( r = 0.60 , P0.0001 ) . Conclusion : The expression of YAP in HCC cell line is significantly lower ( 9 % ) , and the expression of YAP in HCC cell line is low ( 34.58 % ) . The effect of PPIX on the proliferation of human liver cancer cell line MHCC97L and PLC / PRF / 5 was studied . Results : The inhibition rate of PPIX and cisplatin or ADM alone was 30.34 % , 48.20 % and 66.79 % , respectively , and the inhibition rate of PPIX and cisplatin or adriamycin alone was 30.34 % , 48.20 % and 66.79 % respectively .
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 陳自謙;楊利;楊熙章;楊永巖;;肝癌介入治療現(xiàn)狀與進展[J];介入放射學雜志;2008年03期

2 周洲;朱金水;許志朋;;慢病毒siRNA靶向干擾YAP基因胃癌細胞株的建立[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2011年04期

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本文編號：1928568