本文選題：食管鱗癌 + 拷貝數(shù)擴增��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2015年博士論文

【摘要】：食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率占全球腫瘤發(fā)病率的第八位,死亡率占癌癥相關(guān)死亡率的第六位。根據(jù)組織病理類型分類,食管癌可分為兩種主要類型：食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)和食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。ESCC在所有食管癌病例中約占90%,而中國是ESCC的高發(fā)地區(qū),其中約70%發(fā)生在中國。在過去三十年中,食管鱗癌的診斷,分期和治療水平均有很大的提高。然而,ESCC的長期預(yù)后仍然難言樂觀,五年生存率只有15%-25%。進一步深入了解食管鱗癌的發(fā)病機理、尋找食管鱗癌診斷的分子標志物、確定研發(fā)臨床治療的藥物靶點以及制定有效治療方案具有重要的臨床意義。本課題通過全基因組測序和比較基因組雜交芯片技術(shù),發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌樣本中,11ql3.3-11q13.4區(qū)域存在高頻率的擴增現(xiàn)象,而且,該區(qū)域內(nèi)有一個miRNA——miR-548k至今未見其與疾病相關(guān)的報道。通過分析,我們發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域拷貝數(shù)擴增與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有非常顯著的相關(guān)性(p0.001)。為了進一步明確miR-548k在食管鱗癌的臨床意義,我們對93例食管鱗癌組織標本及其配對癌旁組織標本進行RNA原位雜交實驗。結(jié)果表明,miR-548k在食管鱗癌中存在過表達并且與生存預(yù)后和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。進而,我們通過細胞模型和裸鼠模型全面而系統(tǒng)地研究了miR-548k的生物學(xué)功能,揭示其具有癌基因特性,能夠促進食管鱗癌胞的惡性表型,具體表現(xiàn)為促進細胞增殖,增強克隆形成能力,加速細胞周期G2/M期進展,增強細胞的運動和侵襲能力,促進裸鼠成瘤,增強移植瘤的局部浸潤能力和促進細胞發(fā)生血行肺轉(zhuǎn)移。新生淋巴管的形成是癌細胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的必要條件。我們研究發(fā)現(xiàn),miR-548k高表達細胞的分泌物能夠增強淋巴管內(nèi)皮細胞HDLEC的遷移能力和成管能力。進一步我們通過裸鼠模型在體研究miR-548k與淋巴管形成之間的關(guān)系。實驗結(jié)果進一步確認miR-548k能夠促進裸鼠成瘤并且其對應(yīng)的膝窩處淋巴結(jié)明顯大于對照組。免疫組化結(jié)果表明,所有實驗組及部分對照組的膝窩處淋巴結(jié)均發(fā)現(xiàn)食管鱗癌細胞轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,而且實驗組中的染色強度明顯高于對照組,同時,實驗組移植瘤中不管是瘤體周圍或瘤體內(nèi)部,淋巴管的數(shù)目都明顯多于對照組。此外,膝窩處淋巴結(jié)外圍淋巴管的數(shù)量也明顯多于對照組。分子機制研究表明,miR-548k通過下調(diào)細胞周期G2期檢測點激酶Weel而加速G2/M期進展,促進細胞增殖。并且,miR-548k能夠靶向EGFR的轉(zhuǎn)錄抑制因子KLF10,進而上調(diào)EGFR的水平,激活EGFR下游Akt和Erk通路,促進食管鱗癌細胞系的惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。此外,miR-548k可能通過抑制ADAMTS1的表達而促進淋巴管新生過程。綜上所述,本課題首次發(fā)現(xiàn)miR-548k在食管鱗癌中具有高頻率的拷貝數(shù)擴增,并且其過表達與食管鱗癌病人的生存及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。體外和體內(nèi)的生物學(xué)功能研究表明,miR-548k過表達能夠促進食管鱗癌細胞的惡性表型。靶基因研究系統(tǒng)地揭示了miR-548k調(diào)控食管鱗癌惡性進展的分子機制,miR-548k通過靶向細胞周期調(diào)控因子Weel和轉(zhuǎn)錄抑制因子KLF10而調(diào)控食管鱗癌細胞的增殖、運動和侵襲等能力,而通過靶向ADAMTS1調(diào)控食管鱗癌細胞對淋巴管內(nèi)皮細胞的趨化以及促進新生淋巴管形成。食管鱗狀上皮細胞癌(簡稱食管鱗癌,ESCC)是在全球范圍內(nèi)尤其是在中國地區(qū)最為常見的侵襲性和致死性的惡性腫瘤之一。在中國,食管鱗癌導(dǎo)致的腫瘤相關(guān)死亡率占全部腫瘤的第四位。本室前期通過全基因組測序全面而系統(tǒng)地揭示了食管鱗癌的基因組改變情況全景圖,該成果使得我們可以從本質(zhì)上更深入地了解ESCC惡變的基因機制。本研究發(fā)現(xiàn),在所有檢測到的基因變異中,PCLO的突變率為15.9%,拷貝數(shù)擴增頻率為11.4%,是改變最明顯的腫瘤相關(guān)基因之一。我們進一步研究PCLO的蛋白(Piccolo)水平與ESCC的不同臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性。首先,我們對469對具有詳細臨床信息的ESCC組織及其癌旁組織的石蠟包埋標本進行了免疫組化實驗分析。結(jié)果表明,Piccolo在癌組織及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中的表達量高于癌旁組織(p=0.0028)。有意思的是,我們發(fā)現(xiàn)Piccolo在腫瘤組織和轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中同時過表達(p0.001,rs=0.502),提示Piccolo過表達的病人更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。癌組織中Piccolo的表達水平與臨床分期(p=0.001),病人總生存時間(p=0.008),病人無病生存時間(p=0.004)和瘤栓(p=0.013)之間均顯著相關(guān)；此外,Piccolo的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.099)和病理分級(p=0.095)之間存在潛在的相關(guān)性。值得一提的是,Piccolo過表達與ESCC病人的低生存率(包括總生存和無病生存)顯著相關(guān)(p=0.001,Kaplan-Meier survival analysis and log-rank test)。Piccolo表達陽性組的5年生存率(47.8%)相對于Piccolo表達陰性組(68.9%)有實質(zhì)性的降低。對于總生存時間而言,Piccolo表達陰性組的中位生存時間為150個月(95% CI68.136～231.864),而Piccolo表達陽性組的中位生存時間僅為47個月(95%CI34.345～59.655)。對于無病生存時間而言,Piccolo表達陰性組的中位生存時間為141個月(95% CI 82.992～199.008),而Piccolo表達陽性組的中位生存時間僅為37個月(95%CI 27.235～46.765)。單變量Cox回歸生存分析也顯示Piccolo染色為陽性的病人相比與Piccolo陰性的病人其不良預(yù)后的風險更高(總生存HR=1.665,95% CI 1.227～2.25,無病生存：HR=1.618,95% CI 1.208-2.168)。很有意思的是,在T1期ESCC樣本,Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗結(jié)果顯示,Piccolo的過表達與總生存(p=0.004)和無病生存(p=0.004)預(yù)后差密切相關(guān)。此外,Piccolo過表達的病人出現(xiàn)不良預(yù)后的風險相對較高(總生存：HR=2.393,95% CI 1.295-4.424無病生存：HR=2.398,95% CI 1.324～4.341)。多變量Cox回歸生存模型分析,結(jié)果表明Piccolo的表達水平可以作為獨立的生存預(yù)后因素(總生存：p0.001,HR=4.77,95% CI 2.129～10.689；無病生存：p0.001HR=4.003,95% CI 1.871to 8.564)。綜上所述,Piccolo表達水平可能作為早期ESCC預(yù)后的分子標志物。為了進一步明確Piccolo在食管鱗癌惡性進展中的作用,我們通過一系列體外細胞學(xué)實驗和體內(nèi)動物模型實驗研究發(fā)現(xiàn)敲降Piccolo之后能夠減弱ESCC細胞的增殖和克隆形成能力,導(dǎo)致ESCC細胞發(fā)生G2/M期阻滯,抑制ESCC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,抑制ESCC細胞的裸鼠成瘤和肺轉(zhuǎn)移能力。分子機制研究表明,敲降Piccolo能夠促進EGFR內(nèi)化,并提高EGF R的泛素化水平,導(dǎo)致其分選至晚期內(nèi)吞小體的數(shù)量增多,促進EGFR發(fā)生降解。Piccolo能夠與E3泛素連接酶Siahl結(jié)合并抑制其與EGFR結(jié)合,從而穩(wěn)定EGFR的蛋白水平。進一步的研究發(fā)現(xiàn),Piccolo參與調(diào)控的ESCC惡性表型部分依賴于EGFR而起作用的。敲降Piccolo夠抑制EGFR下游Akt和Erk通路的活性。異源表達EGFR能夠部分恢復(fù)由于Piccolo下調(diào)而導(dǎo)致的ESCC表型改變。實驗中我們觀察到Piccolo顯示出很強的膜染色現(xiàn)象,這表明了Piccolo是一種膜蛋白,可能成為一個潛在的治療靶點。我們制備了靶向Piccolo的鼠源單克隆抗體(Piccolo mAb)并驗證了Piccolo mAb具有一定抑制細胞增殖和裸鼠移植瘤形成的效果。總之,本研究首次從基因、臨床、功能、機理和治療的等不同層面上,廣泛而深入地揭示Piccolo通過介導(dǎo)EGFR信號通路在食管鱗癌惡性進展中發(fā)揮的作用,并闡明其有可能成為食管鱗癌的潛在預(yù)后分子標志物和治療新靶點。細胞在進化中形成一套精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來進行DNA損傷應(yīng)答和修復(fù),通常稱為DNA損傷修復(fù)應(yīng)激系統(tǒng)(DNA damage response,DDR).-旦DDR系統(tǒng)感知細胞基因組遭受到攻擊,信號就會發(fā)生級聯(lián)傳遞下去,從而促進修復(fù)損傷的DNA。p53是重要的抑癌基因,處于腫瘤相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心,可保證細胞周期的正確運行,促進DNA修復(fù),誘導(dǎo)細胞凋亡,在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要的作用。許多與p53相關(guān)的microRNA(miRNA)在DNA損傷修復(fù)應(yīng)激系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究中,我們利用miRNA表達譜芯片檢測UV-C照射之后0h.4h.8h和12h時間點HCT116 p53+/+細胞和HCT116 p53-/-細胞中miRNA的表達情況。分析結(jié)果表明,在HCT116 p53+/+細胞或HCT116 p53-/-細胞中,照射之后4h與沒有照射相比較,兩種細胞系中發(fā)生應(yīng)激而表達水平發(fā)生改變的,niRNAs在數(shù)量上差別不大,并且以表達下調(diào)為主。這些結(jié)果提示,在DNA損傷應(yīng)激早期,細胞可能通過迅速降解部分miRNAs而上調(diào)其靶基因的水平來對損傷進行快速應(yīng)答。而且,UV-C誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答可能與p53的狀態(tài)(有/無)有關(guān)系,因為在HCT116 p53+/+細胞或HCT116 p53-/-細胞中發(fā)生差異表達的miRNAs并不一樣。很有意思的是,我們發(fā)現(xiàn)UV-C照射之后不同時間點發(fā)生變化的miRNAs在HCT116 p53+/+細胞中主要以下調(diào)為主,而在HCT116 p53-/-細胞中卻有很多上調(diào)的miRNAs.另外,UV-C照射之后隨著時間的進展,HCT116 p53-/細胞中因應(yīng)激而發(fā)生差異表達的miRNAs越來越多；而在HCT116 p53+/+細胞中,8h這個時間點上發(fā)生變化的miRNAs最多,而4h和12h時候都相對比較少。另外,我們通過比較不同時間點上HCT116 p53+/+細胞和HCT116 p53-/-細胞的差異,尋找跟p53相關(guān)的miRNAs.結(jié)果表明,HCT116 p53+/+田胞相對于HCT116 p53-/-細胞,在UV-C照射之后4h時間點上,有許多miRNAs表達上調(diào),在隨后的時間點上,其中有部分miRNAs相繼表達下調(diào)。這提示在DNA損傷應(yīng)答的早期,p53上調(diào)一些miRNAs參與相關(guān)應(yīng)答。從這些結(jié)果中,我們可以發(fā)現(xiàn),UV-C導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)應(yīng)答過程中,許多miRNAs是以動態(tài)的方式參與調(diào)控的,其中有些可能是依賴于p53的轉(zhuǎn)錄功能。進一步分析發(fā)現(xiàn)有大約50%(59/120)的差異表達miRNAs具有p53-DNA結(jié)合motif.我們應(yīng)用超幾何分布模型研究發(fā)生差異表達的miRNAs在染色體的定位分布,結(jié)果顯示定位于第13/17號染色體和X染色體的miRNAs相對于其它染色體上的miRNAs參與DNA損傷應(yīng)答的可能性較高。我們利用在線miRNAs分析系統(tǒng)MiRSystem來預(yù)測這些差異表達miRNAs的功能和所介導(dǎo)的信號通路,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在UV-C誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答過程中,MAPK通路也是一條受到影響最多的通路之一。此外,Wnt通路、黏附通路(Focal Adhesion Pathway)和p53通路也被富集到參與UV-C誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答中。最后,我們還研究了其中一個miRNA——miR-320a的功能,發(fā)現(xiàn)miR-320a有利于細胞在遭受DNA損傷之后的存活。綜上所述,本課題動態(tài)研究了UV-C照射導(dǎo)致細胞發(fā)生DNA損傷應(yīng)激情況下miRNAs的變化情況,新發(fā)現(xiàn)了許多參與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的iRNAs,這為后續(xù)研究miRNAs口何參與調(diào)控DNA損傷應(yīng)答提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。由于很多結(jié)腸癌患者中存在DNA損傷應(yīng)答通路缺陷,本研究能夠為更好理解結(jié)腸癌的發(fā)病機制及進展提供一定的理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Telomere and telomerase in the initial stage of immortalization of esophageal epithelial cell[J];World Journal of Gastroenterology;2002年02期

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本文編號：1926212