本文選題：食管鱗癌 + 拷貝數(shù)擴(kuò)增��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2015年博士論文

【摘要】：食管癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率占全球腫瘤發(fā)病率的第八位,死亡率占癌癥相關(guān)死亡率的第六位。根據(jù)組織病理類(lèi)型分類(lèi),食管癌可分為兩種主要類(lèi)型：食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)和食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。ESCC在所有食管癌病例中約占90%,而中國(guó)是ESCC的高發(fā)地區(qū),其中約70%發(fā)生在中國(guó)。在過(guò)去三十年中,食管鱗癌的診斷,分期和治療水平均有很大的提高。然而,ESCC的長(zhǎng)期預(yù)后仍然難言樂(lè)觀,五年生存率只有15%-25%。進(jìn)一步深入了解食管鱗癌的發(fā)病機(jī)理、尋找食管鱗癌診斷的分子標(biāo)志物、確定研發(fā)臨床治療的藥物靶點(diǎn)以及制定有效治療方案具有重要的臨床意義。本課題通過(guò)全基因組測(cè)序和比較基因組雜交芯片技術(shù),發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌樣本中,11ql3.3-11q13.4區(qū)域存在高頻率的擴(kuò)增現(xiàn)象,而且,該區(qū)域內(nèi)有一個(gè)miRNA——miR-548k至今未見(jiàn)其與疾病相關(guān)的報(bào)道。通過(guò)分析,我們發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域拷貝數(shù)擴(kuò)增與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有非常顯著的相關(guān)性(p0.001)。為了進(jìn)一步明確miR-548k在食管鱗癌的臨床意義,我們對(duì)93例食管鱗癌組織標(biāo)本及其配對(duì)癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,miR-548k在食管鱗癌中存在過(guò)表達(dá)并且與生存預(yù)后和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。進(jìn)而,我們通過(guò)細(xì)胞模型和裸鼠模型全面而系統(tǒng)地研究了miR-548k的生物學(xué)功能,揭示其具有癌基因特性,能夠促進(jìn)食管鱗癌胞的惡性表型,具體表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖,增強(qiáng)克隆形成能力,加速細(xì)胞周期G2/M期進(jìn)展,增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力,促進(jìn)裸鼠成瘤,增強(qiáng)移植瘤的局部浸潤(rùn)能力和促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生血行肺轉(zhuǎn)移。新生淋巴管的形成是癌細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的必要條件。我們研究發(fā)現(xiàn),miR-548k高表達(dá)細(xì)胞的分泌物能夠增強(qiáng)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞HDLEC的遷移能力和成管能力。進(jìn)一步我們通過(guò)裸鼠模型在體研究miR-548k與淋巴管形成之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)miR-548k能夠促進(jìn)裸鼠成瘤并且其對(duì)應(yīng)的膝窩處淋巴結(jié)明顯大于對(duì)照組。免疫組化結(jié)果表明,所有實(shí)驗(yàn)組及部分對(duì)照組的膝窩處淋巴結(jié)均發(fā)現(xiàn)食管鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,而且實(shí)驗(yàn)組中的染色強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組,同時(shí),實(shí)驗(yàn)組移植瘤中不管是瘤體周?chē)蛄鲶w內(nèi)部,淋巴管的數(shù)目都明顯多于對(duì)照組。此外,膝窩處淋巴結(jié)外圍淋巴管的數(shù)量也明顯多于對(duì)照組。分子機(jī)制研究表明,miR-548k通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期G2期檢測(cè)點(diǎn)激酶Weel而加速G2/M期進(jìn)展,促進(jìn)細(xì)胞增殖。并且,miR-548k能夠靶向EGFR的轉(zhuǎn)錄抑制因子KLF10,進(jìn)而上調(diào)EGFR的水平,激活EGFR下游Akt和Erk通路,促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞系的惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。此外,miR-548k可能通過(guò)抑制ADAMTS1的表達(dá)而促進(jìn)淋巴管新生過(guò)程。綜上所述,本課題首次發(fā)現(xiàn)miR-548k在食管鱗癌中具有高頻率的拷貝數(shù)擴(kuò)增,并且其過(guò)表達(dá)與食管鱗癌病人的生存及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。體外和體內(nèi)的生物學(xué)功能研究表明,miR-548k過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的惡性表型。靶基因研究系統(tǒng)地揭示了miR-548k調(diào)控食管鱗癌惡性進(jìn)展的分子機(jī)制,miR-548k通過(guò)靶向細(xì)胞周期調(diào)控因子Weel和轉(zhuǎn)錄抑制因子KLF10而調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲等能力,而通過(guò)靶向ADAMTS1調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化以及促進(jìn)新生淋巴管形成。食管鱗狀上皮細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱(chēng)食管鱗癌,ESCC)是在全球范圍內(nèi)尤其是在中國(guó)地區(qū)最為常見(jiàn)的侵襲性和致死性的惡性腫瘤之一。在中國(guó),食管鱗癌導(dǎo)致的腫瘤相關(guān)死亡率占全部腫瘤的第四位。本室前期通過(guò)全基因組測(cè)序全面而系統(tǒng)地揭示了食管鱗癌的基因組改變情況全景圖,該成果使得我們可以從本質(zhì)上更深入地了解ESCC惡變的基因機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn),在所有檢測(cè)到的基因變異中,PCLO的突變率為15.9%,拷貝數(shù)擴(kuò)增頻率為11.4%,是改變最明顯的腫瘤相關(guān)基因之一。我們進(jìn)一步研究PCLO的蛋白(Piccolo)水平與ESCC的不同臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性。首先,我們對(duì)469對(duì)具有詳細(xì)臨床信息的ESCC組織及其癌旁組織的石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果表明,Piccolo在癌組織及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中的表達(dá)量高于癌旁組織(p=0.0028)。有意思的是,我們發(fā)現(xiàn)Piccolo在腫瘤組織和轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中同時(shí)過(guò)表達(dá)(p0.001,rs=0.502),提示Piccolo過(guò)表達(dá)的病人更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。癌組織中Piccolo的表達(dá)水平與臨床分期(p=0.001),病人總生存時(shí)間(p=0.008),病人無(wú)病生存時(shí)間(p=0.004)和瘤栓(p=0.013)之間均顯著相關(guān)；此外,Piccolo的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.099)和病理分級(jí)(p=0.095)之間存在潛在的相關(guān)性。值得一提的是,Piccolo過(guò)表達(dá)與ESCC病人的低生存率(包括總生存和無(wú)病生存)顯著相關(guān)(p=0.001,Kaplan-Meier survival analysis and log-rank test)。Piccolo表達(dá)陽(yáng)性組的5年生存率(47.8%)相對(duì)于Piccolo表達(dá)陰性組(68.9%)有實(shí)質(zhì)性的降低。對(duì)于總生存時(shí)間而言,Piccolo表達(dá)陰性組的中位生存時(shí)間為150個(gè)月(95% CI68.136～231.864),而Piccolo表達(dá)陽(yáng)性組的中位生存時(shí)間僅為47個(gè)月(95%CI34.345～59.655)。對(duì)于無(wú)病生存時(shí)間而言,Piccolo表達(dá)陰性組的中位生存時(shí)間為141個(gè)月(95% CI 82.992～199.008),而Piccolo表達(dá)陽(yáng)性組的中位生存時(shí)間僅為37個(gè)月(95%CI 27.235～46.765)。單變量Cox回歸生存分析也顯示Piccolo染色為陽(yáng)性的病人相比與Piccolo陰性的病人其不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)更高(總生存HR=1.665,95% CI 1.227～2.25,無(wú)病生存：HR=1.618,95% CI 1.208-2.168)。很有意思的是,在T1期ESCC樣本,Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示,Piccolo的過(guò)表達(dá)與總生存(p=0.004)和無(wú)病生存(p=0.004)預(yù)后差密切相關(guān)。此外,Piccolo過(guò)表達(dá)的病人出現(xiàn)不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高(總生存：HR=2.393,95% CI 1.295-4.424無(wú)病生存：HR=2.398,95% CI 1.324～4.341)。多變量Cox回歸生存模型分析,結(jié)果表明Piccolo的表達(dá)水平可以作為獨(dú)立的生存預(yù)后因素(總生存：p0.001,HR=4.77,95% CI 2.129～10.689；無(wú)病生存：p0.001HR=4.003,95% CI 1.871to 8.564)。綜上所述,Piccolo表達(dá)水平可能作為早期ESCC預(yù)后的分子標(biāo)志物。為了進(jìn)一步明確Piccolo在食管鱗癌惡性進(jìn)展中的作用,我們通過(guò)一系列體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)敲降Piccolo之后能夠減弱ESCC細(xì)胞的增殖和克隆形成能力,導(dǎo)致ESCC細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯,抑制ESCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,抑制ESCC細(xì)胞的裸鼠成瘤和肺轉(zhuǎn)移能力。分子機(jī)制研究表明,敲降Piccolo能夠促進(jìn)EGFR內(nèi)化,并提高EGF R的泛素化水平,導(dǎo)致其分選至晚期內(nèi)吞小體的數(shù)量增多,促進(jìn)EGFR發(fā)生降解。Piccolo能夠與E3泛素連接酶Siahl結(jié)合并抑制其與EGFR結(jié)合,從而穩(wěn)定EGFR的蛋白水平。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),Piccolo參與調(diào)控的ESCC惡性表型部分依賴(lài)于EGFR而起作用的。敲降Piccolo夠抑制EGFR下游Akt和Erk通路的活性。異源表達(dá)EGFR能夠部分恢復(fù)由于Piccolo下調(diào)而導(dǎo)致的ESCC表型改變。實(shí)驗(yàn)中我們觀察到Piccolo顯示出很強(qiáng)的膜染色現(xiàn)象,這表明了Piccolo是一種膜蛋白,可能成為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。我們制備了靶向Piccolo的鼠源單克隆抗體(Piccolo mAb)并驗(yàn)證了Piccolo mAb具有一定抑制細(xì)胞增殖和裸鼠移植瘤形成的效果�？傊�,本研究首次從基因、臨床、功能、機(jī)理和治療的等不同層面上,廣泛而深入地揭示Piccolo通過(guò)介導(dǎo)EGFR信號(hào)通路在食管鱗癌惡性進(jìn)展中發(fā)揮的作用,并闡明其有可能成為食管鱗癌的潛在預(yù)后分子標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。細(xì)胞在進(jìn)化中形成一套精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)進(jìn)行DNA損傷應(yīng)答和修復(fù),通常稱(chēng)為DNA損傷修復(fù)應(yīng)激系統(tǒng)(DNA damage response,DDR).-旦DDR系統(tǒng)感知細(xì)胞基因組遭受到攻擊,信號(hào)就會(huì)發(fā)生級(jí)聯(lián)傳遞下去,從而促進(jìn)修復(fù)損傷的DNA。p53是重要的抑癌基因,處于腫瘤相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心,可保證細(xì)胞周期的正確運(yùn)行,促進(jìn)DNA修復(fù),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要的作用。許多與p53相關(guān)的microRNA(miRNA)在DNA損傷修復(fù)應(yīng)激系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究中,我們利用miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)UV-C照射之后0h.4h.8h和12h時(shí)間點(diǎn)HCT116 p53+/+細(xì)胞和HCT116 p53-/-細(xì)胞中miRNA的表達(dá)情況。分析結(jié)果表明,在HCT116 p53+/+細(xì)胞或HCT116 p53-/-細(xì)胞中,照射之后4h與沒(méi)有照射相比較,兩種細(xì)胞系中發(fā)生應(yīng)激而表達(dá)水平發(fā)生改變的,niRNAs在數(shù)量上差別不大,并且以表達(dá)下調(diào)為主。這些結(jié)果提示,在DNA損傷應(yīng)激早期,細(xì)胞可能通過(guò)迅速降解部分miRNAs而上調(diào)其靶基因的水平來(lái)對(duì)損傷進(jìn)行快速應(yīng)答。而且,UV-C誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答可能與p53的狀態(tài)(有/無(wú))有關(guān)系,因?yàn)樵贖CT116 p53+/+細(xì)胞或HCT116 p53-/-細(xì)胞中發(fā)生差異表達(dá)的miRNAs并不一樣。很有意思的是,我們發(fā)現(xiàn)UV-C照射之后不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)生變化的miRNAs在HCT116 p53+/+細(xì)胞中主要以下調(diào)為主,而在HCT116 p53-/-細(xì)胞中卻有很多上調(diào)的miRNAs.另外,UV-C照射之后隨著時(shí)間的進(jìn)展,HCT116 p53-/細(xì)胞中因應(yīng)激而發(fā)生差異表達(dá)的miRNAs越來(lái)越多；而在HCT116 p53+/+細(xì)胞中,8h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上發(fā)生變化的miRNAs最多,而4h和12h時(shí)候都相對(duì)比較少。另外,我們通過(guò)比較不同時(shí)間點(diǎn)上HCT116 p53+/+細(xì)胞和HCT116 p53-/-細(xì)胞的差異,尋找跟p53相關(guān)的miRNAs.結(jié)果表明,HCT116 p53+/+田胞相對(duì)于HCT116 p53-/-細(xì)胞,在UV-C照射之后4h時(shí)間點(diǎn)上,有許多miRNAs表達(dá)上調(diào),在隨后的時(shí)間點(diǎn)上,其中有部分miRNAs相繼表達(dá)下調(diào)。這提示在DNA損傷應(yīng)答的早期,p53上調(diào)一些miRNAs參與相關(guān)應(yīng)答。從這些結(jié)果中,我們可以發(fā)現(xiàn),UV-C導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)應(yīng)答過(guò)程中,許多miRNAs是以動(dòng)態(tài)的方式參與調(diào)控的,其中有些可能是依賴(lài)于p53的轉(zhuǎn)錄功能。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)有大約50%(59/120)的差異表達(dá)miRNAs具有p53-DNA結(jié)合motif.我們應(yīng)用超幾何分布模型研究發(fā)生差異表達(dá)的miRNAs在染色體的定位分布,結(jié)果顯示定位于第13/17號(hào)染色體和X染色體的miRNAs相對(duì)于其它染色體上的miRNAs參與DNA損傷應(yīng)答的可能性較高。我們利用在線miRNAs分析系統(tǒng)MiRSystem來(lái)預(yù)測(cè)這些差異表達(dá)miRNAs的功能和所介導(dǎo)的信號(hào)通路,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在UV-C誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答過(guò)程中,MAPK通路也是一條受到影響最多的通路之一。此外,Wnt通路、黏附通路(Focal Adhesion Pathway)和p53通路也被富集到參與UV-C誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答中。最后,我們還研究了其中一個(gè)miRNA——miR-320a的功能,發(fā)現(xiàn)miR-320a有利于細(xì)胞在遭受DNA損傷之后的存活。綜上所述,本課題動(dòng)態(tài)研究了UV-C照射導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生DNA損傷應(yīng)激情況下miRNAs的變化情況,新發(fā)現(xiàn)了許多參與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的iRNAs,這為后續(xù)研究miRNAs口何參與調(diào)控DNA損傷應(yīng)答提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。由于很多結(jié)腸癌患者中存在DNA損傷應(yīng)答通路缺陷,本研究能夠?yàn)楦美斫饨Y(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)展提供一定的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Telomere and telomerase in the initial stage of immortalization of esophageal epithelial cell[J];World Journal of Gastroenterology;2002年02期

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本文編號(hào)：1926212