本文選題：α-gal表位 + anti-Gal抗體��； 參考：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：α-gal表位是廣泛存在于非靈長(zhǎng)類(lèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的碳水化合物結(jié)構(gòu),由GGTA1基因編碼的α1,3GT酶催化形成,能夠與anti-Gal抗體特異性結(jié)合。由于物種進(jìn)化,人類(lèi)細(xì)胞不表達(dá)α-gal表位,但血清中存在天然anti-Gal抗體。α-gal/anti-Gal在物種間的表達(dá)差異為抗腫瘤治療開(kāi)拓了思路,其介導(dǎo)的抗腫瘤免疫治療療效已在黑色素瘤、胰腺癌等動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證,也為結(jié)直腸癌免疫治療提供了新策略。然而,已被應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的α-gal糖脂的治療效果良莠不齊,原因在于該療法主要依賴(lài)患者體內(nèi)潛在的免疫系統(tǒng)功能,但腫瘤患者體內(nèi)DC細(xì)胞和T細(xì)胞功能不足,不能激發(fā)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。近年,免疫細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移治療取得長(zhǎng)足進(jìn)展。筆者認(rèn)為α-gal可聯(lián)合細(xì)胞免疫治療提高抗腫瘤療效。一方面,可利用α-gal表位提高腫瘤免疫原性,誘導(dǎo)新型特異性DC-CTL疫苗,重建患者免疫功能;另一方面,可通過(guò)“病毒-基因”療法誘導(dǎo)自體腫瘤組織表達(dá)α-gal表位,轉(zhuǎn)變?yōu)樽泽w瘤苗,為DC-CTL疫苗提供體內(nèi)治療的靶點(diǎn),在識(shí)別、提呈和效應(yīng)多個(gè)環(huán)節(jié)增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答效果。研究目的：1)通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或組織表達(dá)α-gal表位來(lái)解決腫瘤抗原免疫原性低的難題,為啟動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答奠定基礎(chǔ)。2)研發(fā)新型特異性DC-CTL疫苗,為增強(qiáng)細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移治療的療效奠定基礎(chǔ)。3)初步探討工程化α-gal瘤苗聯(lián)合新型DC-CTL疫苗治療結(jié)直腸癌的可行性和治療策略,為進(jìn)一步完成臨床前研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究方法：1)通過(guò)質(zhì)粒重組、病毒包裝構(gòu)建調(diào)控GGTA1基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)慢病毒Lenti-GGTAl和對(duì)照空轉(zhuǎn)病毒Lenti-control,體外感染人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620和人胃癌細(xì)胞BGC823,建立穩(wěn)定表達(dá)α-gal表位的細(xì)胞瘤苗,Western Blot鑒定基因表達(dá)產(chǎn)物,熒光顯微鏡觀察α-gal表位的定位表達(dá)情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)率。2)通過(guò)質(zhì)粒重組、病毒包裝構(gòu)建E2F-1啟動(dòng)子調(diào)控GGTA1基因表達(dá)的AAV-GGTA1和對(duì)照空轉(zhuǎn)病毒AAV-control,同時(shí)建立裸鼠荷人結(jié)腸癌皮下移植瘤模型,瘤內(nèi)多點(diǎn)注射AAV-GGTA1,并以AAV-control和PBS作為對(duì)照,Western Blot鑒定腫瘤組織內(nèi)融合蛋白表達(dá),冰凍切片間接免疫熒光染色觀察α-gal表位表達(dá)。3)取健康人外周血分離PBMC培養(yǎng)DC和CTL,分別用普通結(jié)腸癌細(xì)胞抗原(SW620-normal)、對(duì)照慢病毒感染后的結(jié)腸癌細(xì)胞抗原(SW620-control)和α-gal修飾的結(jié)腸癌瘤苗抗原(SW620-a-gal)致敏DC,進(jìn)一步激活CTL,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC和CTL細(xì)胞表型,ELISA檢測(cè)DC分泌的IL-12、IL-10以及CTL分泌的TNF-α、IL-4, LDH釋放法檢測(cè)各組CTL的體外殺傷能力。研究結(jié)果：1)經(jīng)多次酶切、PCR和Western Blot鑒定,Lenti-GGTA1和Lenti-control構(gòu)建成功,符合實(shí)驗(yàn)用滴度。以MOI 200感染SW620細(xì)胞、MOI 40感染BGC823細(xì)胞,成功建立人結(jié)腸癌細(xì)胞瘤苗SW620-α-gal和人胃癌細(xì)胞瘤苗BGC823-α-galc通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到α-gal表位表達(dá)于細(xì)胞膜上,實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)97%。2)經(jīng)多次酶切、PCR和測(cè)序鑒定,AAV-GGTA1和AAV-control構(gòu)建成功,滴度符合實(shí)驗(yàn)需要。建立裸鼠荷人結(jié)腸癌皮下移植瘤模型成功率100%。Western Blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織內(nèi)有融合蛋白表達(dá),間接免疫熒光染色可以觀察到腫瘤組織中廣泛表達(dá)α-gal表位。α-gal修飾的結(jié)腸癌抗原致敏的DC疫苗CD80和HLA-DR表達(dá)升高,CD86表達(dá)有升高趨勢(shì),CD83表達(dá)降低,分泌IL-12增加,分泌IL-10降低,以其激活的CD8+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞比例增加,Treg細(xì)胞比例降低,分泌TNF-α增加,體外靶向殺傷能力增強(qiáng)。研究結(jié)論：1)體外實(shí)驗(yàn)中,所制備的慢病毒可以誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞廣泛穩(wěn)定表達(dá)α-gal表位,提高腫瘤細(xì)胞免疫原性。2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,所制備的AAV可以在體感染人結(jié)腸癌腫瘤組織,使其廣泛表達(dá)α-gal表位,轉(zhuǎn)變?yōu)樽泽w瘤苗,提高腫瘤組織免疫原性。3)可以利用α-gal修飾的結(jié)腸癌細(xì)胞抗原制備DC疫苗,該方法可有效激活第二信號(hào)系統(tǒng),使DC活化程度提高,分泌IL-12的功能增強(qiáng),分泌IL-10的功能減低;該DC疫苗可以在體外誘導(dǎo)出強(qiáng)有力的CTL,其CD8表達(dá)增加,NKT細(xì)胞比例增加,Treg細(xì)胞比例降低,分泌TNF-α的能力增強(qiáng)。
[Abstract]:Background: alpha -gal epitope is a carbohydrate structure widely existed on the surface of non primate mammalian cells, catalyzed by alpha 1,3GT enzyme encoded by GGTA1 gene, and can specifically bind to anti-Gal antibody. Human cells do not express alpha -gal epitopes due to species evolution, but there are natural anti-Gal antibodies in serum. Alpha -gal/anti-Gal exists in serum. The difference in expression between species opens up a way of antitumor therapy, and its mediated antitumor immunotherapy has been verified in animal models such as melanoma, pancreatic cancer and other animal models. However, the therapeutic effect of alpha -gal glycolipid, which has been applied to clinical trials, is uncommon. This therapy mainly depends on the potential immune system function in the patient's body, but the function of DC and T cells in the tumor patients is not enough to stimulate the effective anti-tumor immune response. In recent years, the adoptive transfer therapy of immune cells has made great progress. I think that alpha -gal can improve the antitumor effect with cell immunotherapy. On the one hand, it can be used. The alpha -gal epitopes improve the immunogenicity of the tumor, induce a new specific DC-CTL vaccine, and reconstruct the immune function of the patient. On the other hand, it can be induced by the "virus gene" therapy to induce autologous tumor tissue to express the alpha -gal epitopes and turn into the autologous tumor vaccine. It provides the target for the treatment of the DC-CTL vaccine in vivo, and enhances the resistance in recognition, presentation and effect. The effect of tumor immune response. 1) 1) a new specific DC-CTL vaccine was developed by inducing tumor cell or tissue expression of alpha epitopes to solve the problem of low immunogenicity of tumor antigen, to establish a basic.2 for anti-tumor immune response), and to establish a basic.3 for enhancing the effect of cell adoptive transfer therapy. The feasibility and treatment strategy of gal vaccine combined with new DC-CTL vaccine in the treatment of colorectal cancer lay the foundation for further completion of pre clinical research and clinical application. Research methods: 1) the experimental lentivirus Lenti-GGTAl and control Lenti-control, which regulate the expression of GGTA1 gene by plasmid recombination, are constructed by recombinant virus packaging, and the human knot is infected in vitro. Colon cancer cell SW620 and human gastric cancer cell BGC823, establish a cell tumor vaccine that expresses the epitopes of alpha -gal stable, Western Blot identification of gene expression products, fluorescence microscope to observe the localization and expression of alpha -gal epitopes, positive expression rate.2 in flow cytometry, and construct E2F-1 promoter to regulate the GGTA1 gene expression by plasmid recombination and E2F-1 promoter to regulate the GGTA1 gene expression AAV -GGTA1 and control AAV-control were used to establish a model of subcutaneous transplantation of human colon cancer in nude mice. AAV-GGTA1 was injected into the tumor, and AAV-control and PBS were used as control. Western Blot was used to identify the expression of fusion protein in tumor tissue, and the expression of alpha -gal epitopes of frozen section indirect immunofluorescence staining was used to observe the peripheral blood of healthy people. In vitro, DC and CTL were cultured with common colon cancer cell antigen (SW620-normal), colon cancer cell antigen (SW620-control) after lentivirus infection and colon cancer vaccine antigen (SW620-a-gal) modified by alpha -gal (SW620-a-gal) sensitized DC, and CTL was further activated and the phenotype of DC and CTL cells was detected by flow cytometry. L secreted TNF- alpha, IL-4, LDH release assay in vitro to detect the killing ability of CTL in each group. Results: 1) after multiple enzyme digestion, PCR and Western Blot identified, Lenti-GGTA1 and Lenti-control were constructed successfully, conforming to the experimental titer. MOI 200 infected SW620 cells, 40 infected cells and successfully established human colon cancer cell tumor vaccine The BGC823- alpha -galc of gastric cancer cell tumor vaccine can be observed on the cell membrane by fluorescence microscope. The positive expression rate of the experimental group is up to 97%.2). The positive rate of the experimental group is up to 97%.2). After several enzyme cuts, PCR and sequencing are identified, AAV-GGTA1 and AAV-control are successfully constructed, and the titer conforms to the experimental needs. The success rate of the model of the subcutaneous transplantation tumor of the nude mice bearing human colon cancer is 100%.Wes Tern Blot detected the expression of fusion protein in the tumor tissue of the experimental group. Indirect immunofluorescence staining could observe the extensive expression of alpha -gal epitopes in the tumor tissues. The expression of CD80 and HLA-DR in the DC vaccine sensitized by alpha -gal modified colon cancer antigen was elevated, the expression of CD86 was elevated, the expression of CD83 decreased, the secretion of IL-12 increased, and the secretion IL-10 decreased. The proportion of activated CD8+T cells, the proportion of NKT cells increased, the proportion of Treg cells decreased, the secretion of TNF- alpha increased, and the target killing ability in vitro enhanced. 1) in vitro, the prepared lentivirus could induce the human tumor cells to express the alpha -gal epitopes widely and steadily, and improve the immunogenicity of the tumor cells in vivo. In vivo, the prepared AAV can be prepared. In vivo infection of human colon cancer tissue, making it widely expressed in the epitopes of alpha -gal, transforming into an autologous tumor vaccine and improving the tumor tissue immunogenic.3) can be used to prepare the DC vaccine by using the colon cancer cell antigen modified by alpha -gal. This method can effectively activate the second signal system, improve the activation range of DC, enhance the function of the secretory IL-12, and secrete the work of IL-10. It can be reduced; the DC vaccine can induce strong CTL in vitro, increase the expression of CD8, increase the proportion of NKT cells, decrease the proportion of Treg cells, and enhance the ability to secrete TNF- alpha.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：1926131