本文選題：肝細胞癌 + Sox9��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的及背景肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是肝癌中的一種類型,是常見的惡性腫瘤[1],其生物學行為較為惡性,但由于肝臟較強的代償能力,在疾病早期并沒有顯著的癥狀,發(fā)現(xiàn)時腫瘤常常已經(jīng)處于進展期,由于根治性手術治療,包括肝移植和肝腫瘤切除術或射頻消融只適用于部分早期患者[2],中晚期患者缺乏有效的治療手段,故HCC的死亡率居各類腫瘤死亡率的前列。在我國,肝細胞癌多繼發(fā)于乙型肝炎病毒感染,丙型肝炎所致的肝細胞癌近年來比例有所增加。據(jù)報道[3],對于患有病毒性肝炎的病人,其HCC的發(fā)病率是正常人群的20倍。失去手術機會的肝癌病人缺乏有效的治療手段,化療藥物對于進展期HCC的作用并不十分理想。索拉菲尼是一類新型靶向治療HCC的藥物[4],其通過抑制RAF-1、B-RAF的絲/蘇氨酸激酶活性直接抑制腫瘤生長,并且通過FLT-3、VGFR-2、VEGF-3、PDGF-β、KIT等多種受體的酪氨酸激酶活性來抑制腫瘤內(nèi)血管生長從而間接達到抑制腫瘤的目的[9]。但無論是索拉菲尼或化療藥物,HCC的耐藥性一直是阻礙其療效的重要因素,許多文獻報道HCC對于藥物的耐藥性與腫瘤干細胞息息相關。例如Ep CAM陽性的腫瘤干細胞可以介導HCC對于索拉菲尼的耐藥,Oct4陽性的HCC細胞可以產(chǎn)生對多柔比星的耐藥[5、6]。在HCC中腫瘤干細胞的標志有許多,包括Ep CAM,CD90,CD133,Oct4,Nanog等,Sox9近年來亦被認為是HCC中腫瘤干細胞的標志之一,Sox9基因最初被發(fā)現(xiàn)參與性別形成步驟、軀干的發(fā)育及器官的成熟[7],并且最近亦被發(fā)現(xiàn)其表達在多種腫瘤中升高。Sox9表達陽性的細胞顯示出腫瘤干細胞的特性,其促進腫瘤的增殖,并且增強細胞上皮-間質(zhì)轉化,促進癌細胞轉移,并可促進肝癌干細胞自我更新[12]。此外Sox9通過Wnt、Notch、TGF-β通路影響腫瘤的發(fā)生及分化[13],通過Notch通路及Numb蛋白促進肝癌干細胞自我更新及增殖[8]。研究發(fā)現(xiàn),癌組織高表達Sox9的肝癌患者預后更差[11]。故在此,我們希望探索Sox9是否參與HCC對索拉菲尼耐藥的過程,并且探索Sox9調(diào)控HCC對索拉菲尼耐藥的具體生物學機制,從而為解決HCC對索拉菲尼耐藥提供潛在的方法,豐富進展期HCC治療的手段,從而改善一部分臨床患者的預后。研究方法與結果第一部分探討肝細胞癌細胞在使用索拉菲尼后SOX9的表達情況。在這一個部分里,我們使用SMMC-7721及LM3的肝癌細胞系進行體外培養(yǎng),并使用濃度為4μM的索拉菲尼對細胞進行處理,并于0小時,12小時,24小時,36小時,48小時,60小時以及72小時提取細胞RNA及蛋白,并設計Sox9特異性q PCR引物進行定量PCR檢測,使用Sox9特異性抗體通過免疫印跡實驗進行蛋白含量的檢測。此外使用多聚甲醛固定使用4μM索拉菲尼培養(yǎng)0小時,24小時,48小時的細胞,進行免疫熒光及流式細胞儀的檢測。結果:1、在使用4μM的索拉菲尼進行培養(yǎng)后,兩種肝癌細胞系的Sox9表達無論在轉錄水平或是蛋白水平均呈上升趨勢;2、免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)在隨著使用索拉菲尼培養(yǎng)時間的增加,Sox9在核內(nèi)的表達上升。3、流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間增加,細胞中Sox9陽性的細胞數(shù)量顯著增加。第二部分研究Sox9表達及干擾對于肝細胞癌對索拉菲尼耐藥的影響我們首先構建了Sox9過表達及干擾的肝癌細胞系,使用定量PCR及免疫印跡驗證后,使用濃度為4μM的索拉菲尼進行體外培養(yǎng),于1、3、5、7天使用CCK-8試劑進行細胞活力檢測。此外,取培養(yǎng)48小時后的腫瘤細胞進行克隆形成實驗觀察腫瘤細胞的克隆形成能力,同時使用流式細胞儀進行細胞凋亡狀況檢測。結果:1、在使用含有索拉菲尼的培養(yǎng)液培養(yǎng)后,過表達Sox9的肝癌細胞活力高于對照組,而干擾Sox9表達的肝癌細胞活力低于對照組。2、過表達Sox9的肝癌細胞在使用4μM索拉菲尼培養(yǎng)48h后,其克隆形成能力高于對照組,其凋亡水平低于對照組,而干擾Sox9的肝癌細胞的克隆形成能力低于對照組,凋亡水平高于對照組。在已構建的過表達及敲減細胞系中使用慢病毒轉染入luciferase,驗證發(fā)光效率后使用Sox9過表達,Sox9干擾以及對照空病毒細胞構建裸鼠的皮下荷瘤及尾靜脈注射模型,建模后每72小時按20mg/kg體重給予索拉菲尼灌胃處理。與不同觀察節(jié)點(0w,1w,3w,5w,7w)記錄裸鼠體內(nèi)熒光信號值,并于7w后取出皮下荷瘤的瘤體,計量體積并稱重,分析不同處理組的腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的生長情況。結果:1、過表達Sox9組的裸鼠其皮下腫瘤的熒光值高于對照組,7w后其腫瘤重量高于對照組,而干擾Sox9的裸鼠其體內(nèi)腫瘤熒光值低于對照組,7w后腫瘤重量低于對照組。2、在肺轉移模型中,過表達Sox9組的裸鼠肺內(nèi)腫瘤熒光值高于對照組,而干擾Sox9組的裸鼠體內(nèi)熒光信號值低于對照組。第三部分Sox9通過Akt通路影響肝細胞癌對索拉菲尼耐藥性使用Sox9干擾的7721細胞系,以空病毒7721細胞系為對照進行基因表達譜芯片的檢測,檢測不同基因的表達情況。并使用Pathway分析觀察基因在信號通路的富集清情況。之后使用免疫印跡驗證差異基因的表達。結果:1、表達譜芯片顯示在Sox9干擾的細胞系中,下調(diào)的基因在TGF-β,m TOR,VEGF等通路的存在富集現(xiàn)象,其中與腫瘤耐藥密切相關的Akt通路亦存在下調(diào)基因的富集,此外作為Akt下游的耐藥基因,BCRP亦存在顯著下調(diào)。根據(jù)文獻報道,HCC可以通過Oct4-Akt-BCRP產(chǎn)生對化療藥物的耐藥性。之后我們使用免疫印跡實驗驗證了Akt/BCRP通路在Sox9過表達的細胞系中上調(diào),而在Sox9干擾細胞系中下調(diào)。2、免疫熒光實驗結果顯示在使用4μM索拉菲尼處理72小時后的肝癌細胞系中,其Sox9及BCRP的表達均顯著上升。第四部分Sox9通過Akt/BCRP影響HCC對于索拉菲尼的耐藥性使用相應的慢病毒構建Sox9+/BCRP+/Sox9+BCRP-/NC的細胞系,使用4μM索拉菲尼體外培養(yǎng)后進行Brdu,克隆形成及細胞凋亡實驗。使用帶有Luciferase的7721細胞感染相應慢病毒從而構建上述四種細胞系,使用這些細胞系構建裸鼠的腫瘤細胞脾注射肝轉移模型,之后每72h給予索拉菲尼灌胃,使用活體成像儀記錄腫瘤熒光信號。結果顯示:1.在使用索拉菲尼后,Sox9+及BCRP+細胞增殖能力、克隆形成能力較對照組高,而凋亡及壞死細胞的比例較對照組低,而Sox9+BCRP-細胞增殖能力及克隆形成能力較對照組減弱,凋亡及壞死的細胞比例較對照組高。2.Sox9+及/BCRP+的細胞系在裸鼠體內(nèi)的熒光值高于對照組,而Sox9+BCRP-的細胞在裸鼠體內(nèi)的熒光值低于對照組。結論根據(jù)上述結果,結合四部分內(nèi)容,可以總結得到:1、肝細胞癌細胞系在使用索拉菲尼后,其Sox9的表達在m RNA水平或者蛋白水平均逐漸升高,且HCC細胞系中Sox9陽性的細胞比例增高,由此可以推測Sox9升高有助于肝細胞癌提高對索拉菲尼的耐藥性,從而抵抗索拉菲尼對于其的殺傷作用。2、過表達Sox9的肝癌細胞系在索拉菲尼的壓力下,較對照組細胞活力高,增殖能力強,細胞凋亡比例低。在皮下荷瘤及尾靜脈注射轉移的裸鼠模型中,Sox9過表達組的腫瘤在活體成像儀中的信號值更強,而干擾Sox9表達的肝癌細胞系則相反。由此可從另一面驗證Sox9升高能夠提升肝細胞癌對索拉菲尼的耐藥性。3、干擾Sox9的表達譜芯片提示Sox9可影響Akt/BCRP通路的表達,而Akt通路與索拉菲尼耐藥密切相關,所以Sox9可能通過調(diào)控Akt/BCRP通路影響肝細胞癌對于索拉菲尼的耐藥性。之后的拯救實驗顯示在過表達Sox9的肝癌細胞系中干擾BCRP的表達可以逆轉Sox9過表達所帶來的索拉菲尼耐藥性,由此驗證了表達譜芯片中的結論
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1923398