本文選題：急性白血病 + 環(huán)氧合酶-2(COX-2)　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：白血病(leukemia)是造血干/祖細胞出現分化受阻、凋亡障礙和惡性克隆性增生而引起的一組異質性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。目前我國白血病的發(fā)病率為3-4/10萬,在各種惡性腫瘤凋亡率中,白血病在男性患者位居第六位,女性患者位列第八位,在兒童及35歲以下成人中則居首位。研究發(fā)現,與實體腫瘤一樣,血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與血管新生和信號傳導密切相關。目前這一研究已逐漸成為眾多學者關注的焦點。在腫瘤形成過程中,異常的血管生成發(fā)揮著關鍵作用。腫瘤生長依賴于血管生成。腫瘤細胞具有誘導血管生成的潛能,這種潛能必需在生長因子的刺激下才能轉化為發(fā)揮作用的表型。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是最強的血管生長因子之一,是一種十分重要的正性調控因子。近年來,研究表明,白血病患者體液中bFGF水平亦較正常對照明顯升高,骨髓中有明顯的血管新生現象。體內體外的各種實驗均證實了bFGF對于血管內皮細胞的促增殖活性。人們發(fā)現白血病細胞有bFGF和或bFGFR的異常表達,bFGF可以通過自分泌或旁分泌直接刺激白血病細胞,通過加強酪氨酸激酶信號傳導水平促進腫瘤細胞增殖。新生血管持續(xù)不斷的為腫瘤提供營養(yǎng)和排除代謝產物,在腫瘤的發(fā)生、轉移及預后方面起著重要作用。在很多惡性血液病中,血管增生是一個重要的病理生理過程,骨髓血管增生與AML、ALL和CML的預后不良有關。近年來,對AML和CML患者骨髓血管增生和血管內皮生長因子(VEGF)水平之間關系的研究中發(fā)現,與對照組相比,各類型白血病患者骨髓微血管密度都有顯著增高,而且與VEGF有明顯的相關性,其中CML患者骨髓微血管密度及VEGF水平增高最為顯著。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase2, COX-2)在實體瘤中可以促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展,其在白血病中表達也有所提高,COX-2與白血病中VEGF表達及血管新生有關,需要進一步研究證明。COX-2誘導花生四烯酸合成的主要代謝產物PGE2：同樣在腫瘤的血管生成中起作用,誘導血管生長因子如VEGF、bFGF合成。血細胞的增殖、分化、成熟及凋亡受多種具有刺激活性或抑制活性的兩大類所謂正性或負性的細胞因子組成的網絡的調控。轉化生長因子β1 (transforming growth factor β1, TGFβ1)是目前已知的作用最強的血細胞增殖的負調控因子,多種正常血細胞如單核細胞、淋巴細胞、血小板等均能產生TGFβ1,它不僅能刺激成纖維細胞的生長,修復創(chuàng)傷,還能調節(jié)造血,抑制腫瘤細胞的增殖。目前大多研究開展的是對COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF這四種因子單個或兩三個因子進行檢測,并探討其臨床意義,但理論創(chuàng)新不足,應用范圍有限,而本研究通過檢測白血病細胞COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF基因表達與白血病患者血清COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF水平的變化情況,同時對四種因子之間的相關性予以研究,分析各檢測指標在白血病的臨床治療中的指導意義,探討白血病的發(fā)生發(fā)展與血管生成的關系。第一部分：COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF在急性白血病的表達及其意義目的檢測不同類型急性白血病(AL)患者在不同時間段的COX-2、FGF、TGF β1、VEGF等指標的變化情況,分析各檢測指標在AL的診斷、治療及預后判斷中的臨床意義。方法以在安康市中心醫(yī)院就診的90例AL患者為研究對象,以該院體檢中心健康體檢者40例為正常對照,采用ELISA方法檢測血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的含量,并對AL患者進行治療前、后兩個不同階段的動態(tài)檢測；對于AL患者,采用骨髓涂片在顯微鏡下按常規(guī)分類計數200個有核細胞,計算原始加幼稚細胞比例的方法進行診斷。結果1.初診時,AL組的血清COX-2含量出現顯著升高的趨勢,與正常對照組相較,差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P0.001, t/χ2=6.082).2.初診時,AL組的血清bFGF含量出現顯著升高的趨勢,與正常對照組相較,差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P0.001,t/χ2=820.000)。3.AL組初診時血清TGFβ1含量明顯減低,與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.001,t/χ2=860.000)。4.初診時,AL組的血清VEGF含量出現顯著升高的趨勢,與正常對照組相較,差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P0.001, t/χ2=4133.000).5.治療前AML組血清bFGF、COX2、VEGF及TGFβ1水平與ALL組患者比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(分別為P=0.586,χ2=1077.000;P=0.646, χ2= 2906.500; P=0.986,χ2=1135.500; P= 0.729 χ2=2919.000)。6.患者接受2至3個療程的治療后,達到完全緩解(CR)時,患者血清TGFβ1含量逐漸恢復到正常數值,與正常對照組相較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.895,χ2=3774.000)。7.患者接受2至3個療程的治療后,達到完全緩解(CR)時,血清bFGF、COX2及VEGF含量出現顯著降低的趨勢,與正常對照組相較,差異無統(tǒng)計學意義(分別為P=0.806,χ2=3756.000；；P=0.868,χ2= 2173.500;P=0.905,χ2= 2181.000).8.患者接受2至3個療程的治療后,達到完全緩解(CR)時,bFGF、COX2、 VEGF及TGFβ1水平與治療前相較,差異有統(tǒng)計學意義(分別為P0.001,F=61.802;P0.001,F=1342.108;P0.001,F=458.935;P0.001, F=1349.146)。9.AL初診患者治療前血清bFGF、COX2及VEGF水平與骨髓始加幼稚細胞數呈正相關(分別為R=0.0.303,P=0.005；R=0.435,P0.001；R=0.293,P=0.006),而TGFβ1水平與骨髓始加幼稚細胞數呈負相關(R=-0.379, P0.001)。10.AL初診患者治療前血清bFGF、COX2及VEGF水平與TGFβ1水平比較均呈負相關(分別為R=-0.401,P0.001；R=-0.578,P=0.001；R=-0.388,P0.001)。以上數據均采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。結論研究表明,促血管生成因子COX-2、VEGF及bFGF在急性白血病患者血清中含量顯著增加,化療后完全緩解組患者血清COX-2、VEGF及bFGF含量顯著下降,而血清TGF β1水平在急性白血病患者血清中含量明顯減低,而化療后完全緩解組患者血清TGFβ1含量顯著升高,提示血管生成可能在急性白血病的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用。因此,動態(tài)監(jiān)測AL患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF水平,可作為急性白血病病情進展的重要參考指標。第二部分：COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF在慢性粒細胞白血病的表達及其意義目的檢測不同分期慢性粒細胞白血病(CML)患者不同發(fā)展階段血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的變化,對它們在CML的診治和術后干預中的臨床意義進行探討。方法以在安康市中心醫(yī)院就診的50例初診CML患者為研究對象,以該院體檢中心健康體檢者40例為正常對照,采用ELISA方法檢測血清COX-2、bFGF、 TGFβ1及VEGF的含量,并對CML患者進行治療前、后兩個不同階段的動態(tài)檢測；對于AL患者,采用骨髓涂片在顯微鏡下按常規(guī)分類計數200個有核細胞,計算原始加幼稚細胞比例的方法進行診斷。結果1.初診時,CML組各期患者的血清COX-2含量顯著升高,與正常對照組比較,差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P0.001,t/χ2=34.862)。2.初診時,CML組各期患者的血清bFGF含量顯著升高,與正常對照組比較,差異顯著,具有統(tǒng)計學意義差異(P0.001,t/χ2=820.000)。3.CML組各期初診時血清TGFβ1含量明顯減低,與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.001,t/χ2=1289.000);4.初診時,CML組各期患者的血清VEGF含量顯著升高,與正常對照組比較,差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P0.001,t/χ2=1402.000)。5.治療前CML組急變期患者血清bFGF、COX2及VEGF水平較慢性期患者增高,而TGF β 1水平減低,差異均有統(tǒng)計學意義(分別為P0.001,t/χ2=-6.974; P0.001,t/χ2=485.000;P0.001,t/χ=465.000; P0.001,t/χ2=55.000));26.治療前CML組加速期患者血清bFGF、COX2及VEGF水平較慢性期患者增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而TGFβ1水平減低,差異有統(tǒng)計學意義(分別為P0.001,t/χ2=6.117；P0.001,t/χ2=575.000；P0.001,t/χ2= 445.000;P0.001,t/χ2=65.000)。7.經過甲磺酸伊馬替尼治療后,達到完全緩解(包括完全血液學緩解、完全遺傳學緩解及完全分子學緩解)(CR)時,血清bFGF、COX2及VEGF含量明顯下降,而TGFβ1含量基本恢復到正常水平,與正常對照組相較,差異均無統(tǒng)計學意義(分別為P=0.950,t/χ2=-0.063;P=0.983,t/χ2=1518.000; P=0.584, t/χ2=1468.500;P=0.742,t/χ2=1299.000)。8.患者接受甲磺酸伊馬替尼治療后,未達到緩解(包括部分緩解、血液學復發(fā)和耐藥)時,血清bFGF、COX2、VEGF及TGFβ1水平與CR組比較差異顯著,有統(tǒng)計學意義(分別為P0.001,t/χ2=-28.355;P0.001,t/χ2=630.000;P 0.001,t/χ2=137.000;P0.001,t/χ2=123.000)9.CML初診患者治療前血清bFGF、COX2及VEGF水平與TGFβ1水平呈負相關(分別為R=-0.315,P=0.026；R=-0.330,P=0.020；R=-0.632,P0.001)以上數據均采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。結論CML患者初診時存在COX-2、VEGF及bFGF的高表達,TGFβ1在CML初診時存在低表達,經過甲磺酸伊馬替尼治療后,達到完全緩解時,血清COX-2、VEGF、bFGF及TGFβ1含量基本恢復正常,提示與CML的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。根據以上研究,說明動態(tài)監(jiān)測CML患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF水平,可作為CML病情進展的重要參考指標。第三部分：白藜蘆醇對K562細胞COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF基因表達的影響摘要目的：探討COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF對人白血病細胞增殖的影響機制。方法：采用不同濃度白藜蘆醇(Res)及伊馬替尼(IM)對K562細胞進行干預,通過MTT法、臺盼藍染色、Hoechst 33258染色及流式細胞術觀察細胞凋亡情況,同時將K562細胞株分為空白對照組、IM單藥組(0.1μmol/L、0.2μmol/L)、Res單藥組(50μmol/L)；100μmol/L)、200μmol/L)、IM聯(lián)合Res組(IM0.1μmol/L+Res 50μmol/L、IM 0.1μmol/L+Res 100μmol/L、IM 0.1μmol/L+Res 200μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 50μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 100μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 200μmol/L)。采用熒光定量PCR及Western blot檢測其給藥后COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的變化。結果：1、細胞抑制率隨白藜蘆醇及伊馬替尼藥物濃度的增高而呈上升趨勢,各組間相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),與單獨使用白藜蘆醇或者伊馬替尼相比,細胞增殖的抑制率明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中200μmol/mL白藜蘆醇+200μmol/L伊馬替尼組細胞的抑制率最高；隨著時間的延長,白藜蘆醇與伊馬替尼聯(lián)合作用組細胞的增殖抑制作用明顯增高,且當作用72 h時細胞的增殖抑制作用最高。2、臺盼藍拒染實驗檢測兩種藥物聯(lián)合運用后對K562細胞的細胞毒作用。結果表明,各聯(lián)合用藥濃度組對K562細胞的細胞毒作用均高于單用白藜蘆醇組和伊馬替尼組,且當用200μmol/ml白藜蘆醇+0.2μmol/L伊馬替尼作用K562細胞時細胞的凋亡率最高；隨著時間的延長,白藜蘆醇與伊馬替尼聯(lián)合作用后使細胞的凋亡率明顯增高,且當作用72 h時細胞凋亡率為最高。3、采用伊馬替尼及白藜蘆醇對CML細胞株caspase-3進行檢測發(fā)現,隨著白藜蘆醇或伊馬替尼濃度升高,其caspase-3活性逐漸增強。4、流式細胞術檢測顯示單用白藜蘆醇及單用伊馬替尼對人白血病細胞K562均具有凋亡作用,而隨著白藜蘆醇濃度的增加,K562細胞的凋亡率逐漸增高；隨著伊馬替尼濃度的增加,K562細胞的凋亡率逐漸上升。5、Hoechst 33258染色實驗檢測顯示單用白藜蘆醇及單用伊馬替尼對人白血病細胞K562均具有凋亡作用,而隨著白藜蘆醇濃度的增加,K562細胞的凋亡率逐漸增高；隨著伊馬替尼濃度的增加,K562細胞的凋亡率逐漸上升。6.PCR及Western blot結果顯示,相較于對照組,0.2μmol/L伊馬替尼組的COX-2、bFGF及VEGF的表達量明顯降低,而TGFβ1 mRNA的表達均顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；而用200μmol/mL白藜蘆醇±0.2μmol/L伊馬替尼聯(lián)合作用于K562細胞后,細胞中TGFβ1 mRNA的表達明顯增高,而COX-2、bFGF及VEGF mRNA的表達均顯著降低,與對照組和0.2μmol/L伊馬替尼組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。以上數據均采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。結論 白藜蘆醇及伊馬替尼對白血病K562細胞株均具有促進凋亡作用,其聯(lián)用可明顯增加其凋亡率。對血管生成具有抑制作用的白藜蘆醇能夠增加TGFβ1 mRNA和蛋白的表達,減低COX-2、bFGF及VEGF mRNA和蛋白的表達,從而促進K562的凋亡,間接反映血管生成在白血病中的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7

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本文編號：1920520